電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

電気生理学と機能イメージング（カルシウム、電位感受性色素）は、神経科学の中で最も一般的に使用される実験技術の2つです。ここで検討する脳スライス標本および網膜ホールマウントは、麻酔薬や筋弛緩からの汚染することなく、電気生理学的特性およびシナプスの接続性を調べるための手段を提供します。脳スライスおよび網膜ホールマウントは、特定の回路と脳ネットワーク¹の研究を可能にする、培養物又は細胞ホモジネートとは異なり、その構造的完全性を維持します。単離された組織からの記録は、心拍や呼吸に関連した動きとしてin vivoでの録音に比べて利点が排除されています。また、直接可視化は、標的とする細胞の特定のクラス、および薬理学的ツール^2、3の局所適用を可能にします。

パッチクランプ記録とカルクイウムをローディング染料網膜ホールマウントでは、網膜神経節細胞（RGC）層をカバーし、細胞への直接アクセスを防止膜（ILM）を、制限内の存在によって複雑になります。通常、この膜は、単一のセルにギガオームシールのパッチピペットと形成の直接適用を可能にするために、ガラスピペットで削り取られています。また、浴適用カルシウム色素は、ILMと交差しないとのいずれか逆行視神経⁵で次の注射を輸送または組織⁶を介して電気穿孔し、この膜⁴の下に注射しなければなりません。網膜色素変性症、RD / rdマウスのげっ歯類モデルを利用する場合また、ILMは厚く、より不可解です。ここでは、両方のユビキタスカルシウム色素ローディングを可能にするために、酵素消化⁷でILMを除去する技術、およびパッチクランプrecordiのための網膜神経節細胞への直接アクセスを使用しますNGS ^8。

脳スライスまたは網膜ホールマウントのいずれかから成功した記録は、生存可能な神経組織の切開およびインキュベーションに依存します。一般的に、組織は、実験の朝に抽出し、それを記録するために使用されるまで、人工脳脊髄液（aCSFの）中でインキュベートされます。この時間ウィンドウ以下の重大な劣化で、8時間 – 通常、組織は、6のための実行可能なままです。しかし、脳スライスとホールマウント網膜の準備の両方は、通常、この短い期間の中から記録することができるよりも多くの組織を作り出します。したがって、組織は、多くの場合、一日の終わりに廃棄され、切開は、その後の日に再び終了します。これは、別の動物を利用し、セットアップおよび解剖/繰り返し染色の〜2時間されていることを意味します。次のプロトコルが利用されている少数の動物を意味し、24時間以上のために神経組織の寿命を延長するための方法を説明し、より多くの実験時間が利用可能です。組織の生存率ワット電気生理学的特性およびカルシウム動態を記録を通じて評価し、これらのプロパティは、<4時間及び> 24時間postdissection間の区別がつかなかったよう。

これらの結果は、カルシウムイメージングと電気生理学的記録により評価されるように、長時間のインキュベーション後、無傷で機能的単一細胞の特性であるが、ネットワーク活動だけでなくことを示し、> 24時間postdissection変更されません。さらに、我々は、カルシウム色素は、任意の有害な効果を引き起こすことなく、長期間の細胞内に残ることができることを示しています。このプロトコルの適用は、外部環境を高度に調節された後、急性神経組織における神経細胞の機能的活性は、長期間維持することができることを示しています。組織の生存率が異なるインキュベーションプロトコルによる実験室間で大きく変化する。また、この方法は、急性neuの健康状態の変動を低減するために適用されるべき理想的なパラメータのゴールドスタンダードを確立しますRONAL組織。