L'incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Électrophysiologie et d'imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d'examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l'étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux ^1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l' application locale d'outils pharmacologiques ^{2, 3.}

enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l'existence de l'Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l'accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d'une pipette de patch et la formation d'un joint d'étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane ^4, rétrogressivement transporté après l' injection au niveau du nerf optique ⁵ ou électroporation à travers le tissu ^6. En outre, lorsqu'on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l'ILM à la digestion enzymatique ^7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings ^8.

enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l'incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l'expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour l'enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 – 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d'animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l'enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre <4 h et> 24 h postdissection.

Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l'activité du réseau, tel qu'évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé> 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d'effets secondaires nuisibles. L'application de ce protocole démontre que l'activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l'environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d'incubation différents, cette méthode établit une norme d'or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.