Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

1. Fabricação de poliacrilamida Substratos substratos de vidro limpas – quer lâminas de microscópio padrão para imunofluorescência endpoint ou com fundo de vidro 35 mm pratos de Petri para a TFM – a fim de assegurar o ótimo poliacrilamida fabricação e integridade hidrogel durante a cultura de células. Alternativamente, o uso pré-limpas substratos de vidro. Mergulhar em substratos de vidro de 0,25% v / v de Triton X-100 em água destilada (dH2O). Coloque substratos num agitador orbital durante 30 minutos. Remover Triton solução X-100 e enxaguar substratos 5 vezes com substratos dH 2 O. Deixe imersas na lavagem final e coloque em um agitador orbital durante 30 minutos. Remover dH2O e mergulhe substratos em acetona. Coloque substratos num agitador orbital durante 30 minutos. Remover a acetona e mergulhe substratos em metanol. Coloque substratos num agitador orbital durante 30 minutos. Remover o metanol e lavar substratos 5 vezes com dH <sub> 2 substratos O. imerso em NaOH 0,05 N e coloque em um agitador orbital durante 1 h. CUIDADO: NaOH é muito cáustico e pode causar queimaduras na pele e lesões oculares graves. Usar luvas de protecção, roupas e óculos de protecção. Remover e lavar uma solução de NaOH substratos 5 vezes com dH2O Uso de ar comprimido filtrado para secar substratos e cozer a 110 ° C sobre uma placa quente até que seco (5 – 15 minutos). substratos limpos podem ser armazenados à temperatura ambiente indefinidamente. Silanizar substratos de vidro limpo, a fim de garantir a fixação do hidrogel de poliacrilamida. Imergir substratos de vidro limpas na preparada de fresco de 2% v / v de metacrilato de 3- (trimetoxissilil) propilo (3-TPM) em etanol. Coloque substratos num agitador orbital durante 30 minutos. CUIDADO: 3-TPM é um combustível líquido. Manter longe do calor, faíscas, chamas e superfícies quentes e utilizar apenas em uma coifa química. Remoção da solução de 3-TPM e mergulhar substratos em ethanol. Coloque substratos num agitador orbital por 5 min. Use ar comprimido filtrado para secar os substratos e cozer a 110 ° C sobre uma placa quente até que seco (5 – 15 minutos). substratos silanizado pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até um mês. Opção 1: Fabricar hidrogéis de poliacrilamida em lâminas de microscópio silanizadas para imunofluorescência endpoint. Prepara-se uma solução de pré-polímero em dH2O com o / percentagem de bisacrilamida desejado acrilamida (w / v), proporção de fabricar substratos com módulos de 4 kPa (4% de acrilamida, 0,4% de bisacrilamida), 13 kPa (6% de acrilamida, 0,45 de Young % bisacrilamida), ou 30 kPa (8% acrilamida, 0,55% bisacrilamida) e porosidade semelhante, por Wen et ai. 41. solução Vortex até claro e filtro com uma seringa de 0,2 mm. As soluções de pré-polímero pode ser armazenado a 4 ° C durante 3 meses. ATENÇÃO: A exposição à acrilamida ou bisacrylamide pode resultar em toxicidade aguda, Neurotoxicity, e irritação. Usar luvas de protecção, roupas e óculos de protecção. Prepara-se uma solução de foto-iniciador de 20% w / v de Irgacure 2959 em metanol. Esta solução fotoiniciador não pode ser armazenado e deve ser preparado fresco de cada vez. Misturar o pré-polímero e soluções de fotoiniciador numa proporção de 9:: 1 (fotoiniciador pré-polímero). desgaseifica opcionalmente com uma câmara de vácuo durante 15 min para remover as bolhas. Colocar as lâminas silanizadas para um tabuleiro de secagem de vidro e pipetar 100 mL de 9: 1 de pré-polímero: solução de foto-iniciador para cada lâmina. Gentilmente cobrir cada lâmina com uma lamela de 22 mm × 60, evitando a criação de bolhas. Note-se que a lamela impede que a inibição da reacção de polimerização por oxigénio. Tabuleiro de secagem lugar num reticulador de UV e expor as lâminas a 365 nm UV A durante 10 min (4 W / m 2). Otimizar o tempo de polimerização, conforme necessário. Exposições mais longas dificuldade risco de retirar a lamela devido à overpolymerization. exposições mais curtas runderpolymerization isk e baixa estabilidade hidrogel. Mergulhe hidrogéis em dH2O por 5 min. Remover lamelas com uma navalha, tomando cuidado para não danificar os hidrogéis polimerizado. Deixar hidrogeles em dH2O à temperatura ambiente durante 1-3 d, mudando dH2O diária. Desidratar hidrogéis a 50 ° C em uma placa quente até secar (15 – 30 min) e armazenar em temperatura ambiente por até 3 meses. Opção 2: Fabricar hidrogéis de poliacrilamida contendo talão fluorescentes sobre com fundo de vidro placas de Petri de 35 mm silanizadas para avaliação ao vivo de interações-substrato celular utilizando TFM. Sonicar uma solução stock de 1 uM esferas fluorescentes durante 15 minutos para dispersar os agregados. Prepara-se uma solução de pré-polímero em dH2O com o / percentagem de bisacrilamida desejado acrilamida (w / v), proporção de fabricar substratos com módulos de 4 kPa (4% de acrilamida, 0,4% de bisacrilamida), 13 kPa (6% de acrilamida, 0 de Young0,45% bisacrilamida), ou 30 kPa (8% acrilamida, 0,55% bisacrilamida) e porosidade semelhante, por Wen et ai. 41. solução Vortex até claro e filtro com uma seringa de 0,2 mm. As soluções de pré-polímero pode ser armazenado a 4 ° C durante 3 meses. ATENÇÃO: A exposição à acrilamida ou bisacrylamide pode resultar em toxicidade aguda, neurotoxicidade e irritação. Usar luvas de protecção, roupas e óculos de protecção. Adicionar pérolas fluorescentes para a solução de pré-polímero a uma concentração final de 0,2% v / v e agitar com vortex para misturar. Prepara-se uma solução de foto-iniciador de 20% w / v de Irgacure 2959 em metanol. Esta solução fotoiniciador não pode ser armazenado e deve ser preparado fresco de cada vez. Misturar as soluções de pré-polímero / grânulo e fotoiniciadores em uma mistura 9: 1 (pré-polímero / grânulo: fotoiniciador) proporção. desgaseifica opcionalmente com uma câmara de vácuo durante 15 min para remover as bolhas. Coloque silanizadas mm com fundo de vidro pratos de Petri 35 em uma bandeja de secagem de vidro e pipet 20 mL de 9: solução de foto-iniciador para o centro de cada prato: um pré-polímero / grânulo. Gentilmente cobrir cada lâmina com uma lamela circular 12 mm enquanto evitando a criação de bolhas. Note-se que a lamela impede que a inibição da reacção de polimerização por oxigénio. A fim de distribuir as partículas fluorescentes à superfície do hidrogel, inverter os pratos e deixar à temperatura ambiente durante 20 min, por Knoll et ai. 42. Enquanto ainda invertido, expor pratos a 365 nm UV A durante 10 min (4 W / m 2). Otimizar o tempo de polimerização, conforme necessário. Exposições mais longas dificuldade risco de retirar a lamela devido à overpolymerization. Shorter underpolymerization exposições de risco e baixa estabilidade hidrogel. Imergir hidrogeles em 0,1 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) Tampão e deixar à temperatura ambiente durante a noite no escuro. Remova cuidadosamente lamelas com uma navalha, tomando cuidado para não danificar o polymehidrogéis rizados. Desidratar hidrogéis a 50 ° C sobre uma placa quente até que a seco (15 – 30 min). Os hidrogéis podem ser armazenados à temperatura ambiente no escuro durante 3 meses. 2. Fabricação de Arrays Prepare buffers para imprimir biomoléculas. Use o buffer de impressão adequado para as biomoléculas de interesse. factor de crescimento (GF) tampão de impressão é em geral, adequados para outras classes de moléculas, tais como ligandos de célula-célula. Para preparar 2 × tampão de ECM impressão proteína, adicionar 164 mg de acetato de sódio e 37,2 mg de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 6 mL de dH2O Vortex e incubar a 37 ° C para dissolver completamente. Após solubilização, adicionar 50 ul de pré-aqueceu-se Triton X-100 e 4 mL de glicerol. Vortex e incubar a 37 ° C, para solubilizar novamente. Adicionar 40 – 80 mL de ácido acético glacial, titulando-se a ajustar o pH para 4,8. 2 × tampão de ECM impressão de proteína pode ser armazenada a 4° C durante 1 mês. CUIDADO: O ácido acético é inflamável e corrosivo. Usar luvas de protecção, roupas e óculos de protecção. Para preparar 2 × tampão de impressão GF, adicionar 105,5 mg de acetato de sódio e 37,2 mg de EDTA a 6 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Vortex e incubar a 37 ° C para dissolver completamente. Após solubilização, adiciona-se 100 mg de 3 – [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS) e 4 mL de glicerol. 2 × tampão de impressão GF proteína pode ser armazenada a 4 ° C durante 1 mês. Prepare placa de origem. Em uma de 384 poços de microplacas de fundo em V, combinar volumes iguais de 2 × tampão de impressão com cada solução biomolécula com o dobro da concentração alvo. NOTA: Uma concentração alvo apropriada de proteínas de ECM mais comuns é de 250 ug / mL enquanto que as concentrações alvo de outros tipos de factores dispostas variam dependendo da retenção no hidrogel e a função biológica. O volume total em cada poço pode serA partir de 5 mL e não é necessário mais de 15 mL. Para além das combinações de biomoléculas de interesse, incluem um marcador fluorescente dispostas de modo a facilitar a análise de imagem a jusante. Use de dextrano conjugado com rodamina (2,5 mg / mL). Misture cada poço completamente por pipetagem, tomando cuidado para não gerar bolhas. Centrifugar a microplaca fonte durante 1 min a 100 x g. Fabricar micromatrizes utilizando placas de origem preparadas no mesmo dia e armazenados a 4 ° C, até a fabricação de microarray. pins limpos de acordo com as instruções do fabricante antes de cada execução microarray fabricação. Coloque pinos limpas diretamente no cabeçote do microarrayer. Prepare microarrayer e programa usando o software do fabricante. Embora os passos que se seguem são, em parte específica para o microarrayer particular utilizado aqui, a operação da maior parte das microarrayers é semelhante. Ligar o aparelho humidificador, ajustar o ponto de ajuste a 65% RH (sem-condensing) e aguarde até que o reômetro corresponde ao set point. Coloque placa de origem no adaptador apropriado. Desidratar hidrogel substratos a 50 ° C durante 15 min e colocar no adaptador apropriado. O microarrayer tem adaptadores para ambas as lâminas de microscópio e microplacas. Para arraying 35 mm com fundo de vidro placas de Petri, coloque os pratos em uma microplaca de 6 poços e coloque a microplaca no adaptador microplaca na arrayer. Ajustar os parâmetros do programa para refletir com precisão o layout da placa de fonte, design matriz, e o formato desejado (por exemplo, lâmina de microscópio ou microplaca contendo 35 mm placas de Petri). Incluem as etapas de lavagem, utilizando tanto sulfóxido de água e dimetil (DMSO) entre cada condição, a fim de evitar o reporte e a contaminação cruzada. Comece matriz fabricação, verificando nada menos do que uma vez numa hora em que a umidade não caiu abaixo de 65% RH (sem condensação) e que os pinos não estão entupidos. Se a humidity caiu inesperadamente, pausar arraying para encher o humidificador e limpar tubos associados de condensação. Se os pinos estão entupidos, pausar arraying para limpar os pinos ou não substituir com pinos pré-limpos. Note-se que é possível matriz múltiplos tipos de biomoléculas sequencialmente nos mesmos substratos fornecidos tempo de secagem suficiente (isto é, 4 h até durante a noite). Quando o programa estiver concluído, coloque matrizes fabricadas em uma caixa de slides ou microplacas coberto com folha de alumínio à temperatura ambiente e 65% RH (sem condensação) durante a noite. Note-se que pode ser necessário para avaliar a qualidade e retenção matriz usando manchas de proteína geral ou imunofluorescência; veja Brafman et al. para mais detalhes 25. 3. celular Cultura e Ensaio de Leitura O dia após a fabricação, coloque substratos dispostos em 4 câmaras pratos (slides de microscópio) ou 6 microplacas (placas de Petri) e mergulhar em 1%v / v de penicilina / estreptomicina, em PBS; usar 4 mL de slides e 3 mL de pratos. Expor à radiação UV C durante 30 min. Troca de penicilina / estreptomicina solução para o meio de cultura celular. Coletar e contagem de células. Semente para matrizes em 500 × 03-2 outubro × 10 6 células / matriz em 4 ml por lâmina de microscópio e 3 mL por placa de Petri de 35 milímetros. Incubar as culturas de matriz a 37 ° C e 5% de CO2 durante 2-24 h ou até que a formação de ilhas de células bem povoadas. Ajustar a densidade de semeadura e do tempo como necessário para as suas células e aplicação em particular. Underseeding (ou seja, de baixa densidade ou tempo de envio) pode resultar na população pobre da matriz e resultados biológicos distorcidas. Overseeding (ou seja, alta densidade ou época de semeadura) pode resultar na integridade matriz reduzida devido ao descolamento ilha. Depois de permitir que para a formação de ilhas de células, culturas de matriz lavar duas vezes com meio de cultura de células pré-aquecida; mais uma vez usar 4 mL de slides e 3 mL de pratos. optionally adicionar controlos e tratamentos apropriados (por exemplo, inibidores de moléculas pequenas, factores de crescimento, etc.) de interesse do sistema biológico. Mudar os meios das matrizes de cada 1-2 d a fim de manter a concentração de todos os tratamentos. Avaliar a expressão do marcador celular e função das células por imunofluorescência ou célula-substrato interações por TFM dentro de 1-5 d de iniciar culturas de matriz – ver Opção 1 e Opção 2 abaixo. Opção 1: Execute imunofluorescência endpoint. Note-se que a imunofluorescência de algumas proteínas podem necessitar de permeabilização mais rigorosa utilizando-se metanol, etanol, ou HCl. Devido ao potencial de danos ao matrizes, avaliar e otimizar cada protocolo permeabilização antes do uso em experimentos em larga escala. Aspirar o meio de cultura celular a partir de lâminas de matriz em 4 pratos câmaras e adicionar 4 mL / corrediça de recém-preparado de 4% v / v de paraformaldeído (PFA) em PBS. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. CUIDADO: Exposure a PFA pode resultar em toxicidade aguda e também pode irritar ou corroer pele em contato. Usar luvas de protecção, roupas e proteção para os olhos e utilizar apenas em uma coifa química. Aspirar solução PFA e lave cada lâmina 3 vezes com 4 ml de PBS. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 1 semana. É aconselhável, no entanto, continuar através de imunomarcação e montagem no mesmo dia que a fixação, a fim de assegurar a integridade da matriz. Aspirar PBS e adicionar 4 mL / corrediça de 0,25% v / v de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o Triton X-100 a solução e lava-se cada lâmina 3 vezes com 4 ml de PBS. Adicionar 4 ml / corrediça de 5% v / v de soro combinado com a espécie de anticorpo secundário (por exemplo, soro de burro para anticorpos secundários de burro) em PBS e incuba-se à temperatura ambiente durante 1 h. Completamente remover a solução de bloqueio de cada slide. Adicionar 500? L / corrediça de anticorpo primário diluído em 5% v / v de soro em PBS. Este volume é suficiente para cobrir matrizes para ambas as incubações de 1 h à temperatura ambiente, bem como as incubações durante a noite a 4 ° C. Lavar cada lâmina de matriz 3 vezes com 4 ml de PBS. Cuidadosamente remover a lavagem final e adicionar 500 mL / corrediça do anticorpo secundário apropriado diluído em 5% v / v de soro em PBS. Lavar cada lâmina de matriz 3 vezes com 4 ml de PBS. Lavar brevemente com dH2O antes de retirar cuidadosamente corrediças da disposição da solução usando uma pinça. Use um tecido de laboratório para pavio ou seco dH residual 2 O. Pipetar 100 L de solução com DAPI montagem em toda a corrediça enquanto confirma visualmente a cobertura completa de toda a matriz. Coloque um mm lamela de 22 x 60 sobre a lâmina de montar. Selar as bordas da lamela com unhas polonês claro. Loja no escuro a 4 ° C até imagiologia, o mais tardar, no dia seguinte. Imagem matrizes inteiras usando quer um scanner de microarray ou invertida equ microscópio fluorescenteed com um palco robótico. Scanners microarray fornecer leitura mais rápido, mas pode exigir Cy3- ou Cy5 compatíveis com fluoróforos e são muitas vezes de resolução limitada a fim de células individuais (ou seja, 1 – 10 m). microscópios fluorescentes proporcionam a opção de utilizar uma variedade de canais fluorescente e maior resolução (<1 um, ~ 100 vezes no total), mas proporcionar leitura mais lento, dependendo da qualidade do palco robótico e ampliação / objectivo. Guardar as imagens capturadas de matrizes inteiras de qualquer método como arquivos TIFF, a fim de evitar a compressão de dados ou perda associada a outros formatos de arquivo (por exemplo, JPG). Opção 2: Realizar a avaliação ao vivo de interações-substrato celular utilizando TFM. Prepara-se uma solução de 1% v / v de albumina de soro bovino (BSA) e 1% v / v de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) em PBS para dissociar as células a partir de substratos durante TFM. Mova 35 mm placas de Petri contendo as culturas de matriz paraum (CO 37 ° C, 5% 2) incubados, microscópio de fluorescência invertido, com uma fase robótico para medições TFM. Em um prato, marcar as posições (coordenada X, coordenada Y) e se concentrar aviões (coordenada Z) de ilhas de células individuais usando microscopia de contraste de fase. Mudar para a microscopia de fluorescência vermelha extrema para visualizar as contas. Voltar para cada uma das posições gravados na etapa anterior e corrigir a coordenada Z do plano de foco de modo que apenas a primeira camada de esferas abaixo da ilha celular está em foco. Salvar as novas coordenadas e proceder à imagem automatizado de todas as ilhas celulares para capturar contraste de fase pré-dissociação e imagens fluorescentes vermelhas distantes. Adiciona-se cuidadosamente 150 ul de solução de BSA / SDS para o prato e esperar cinco minutos para permitir a dissociação de células completas a partir do substrato; monitorar dissociação celular utilizando microscopia de contraste de fase. Após as ilhas de células foram dissociadas a partir do substrato, de regresso para tele marcou posições e verificar que a primeira camada de contas ainda estão em foco. Se estes grânulos são fora do plano devido à deformação induzida por tracção gerada por células, em seguida, corrigir a coordenada Z do plano de foco de modo que eles são de novo em foco. Save the Z-coordenadas corrigidas e repita imagem automatizado de todas as ilhas para capturar pós-dissociação imagens fluorescentes muito vermelhas. Repita os passos 3.5.1 – 3.5.4 para os pratos restantes. 4. Análise de Dados Análise de dados de imunofluorescência. Processo de imagens adquiridas matriz. Dividir imagens de matriz de compósitos em arquivos contendo canais individuais (ou seja, vermelho, azul ou verde) e converter em imagens TIFF de 8 bits 43, 44. Aplicar binning (por exemplo, 2 × 2 ou 4 × 4) para reduzir o tamanho da imagem para ~ 32 megapixels por canal para reduzir os requisitos de memória durante a análise de uma única célula a jusante da entire imagens de matriz. Veja arquivo de código suplementar intitulado "array_processing.ijm" para uma implementação macro ImageJ dessas etapas de processamento de matriz. Observe as coordenadas em pixels do canto superior esquerdo, inferior esquerdo, e marcadores de rodamina conjugada inferior direito dextrano ou condições dispostas. Use essas coordenadas para girar as imagens de 8 bits TIFF para ser perfeitamente vertical e, depois, para anotar de saída a partir da análise de uma única célula com as condições dispostas específicos. Ver Suplementar arquivos de código intitulada "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm", e "array_gridding.ijm" para implementações destas matriz rotativa e gridding passos. Realizar análise de uma única célula de binned, rodado imagens TIFF de 8 bits em CellProfiler (versão 2.1.1) 45 utilizando os seguintes módulos: IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects e MeasureObjectIntensity. IdentifyPrimaryObjects identifica núcleos, IdentifySecondaryObjects identifica immunolabels associados com cada núcleo da célula, e fornece MeasureObjectIntensity quantificações para ambos os marcadores nucleares e immunolabels. dados de uma única célula de saída de todas as três módulos como um arquivo CSV por canal usando o módulo ExportToSpreadsheet para facilitar a análise posterior a jusante. Veja Suplementar arquivos de código intitulado "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe", e "rgb_array_image_analysis.cppipe" para as condutas CellProfiler execução estes passos para conjuntos de imagens que contêm canais vermelho, verde ou azul. Para transformar os dados para explicar a variabilidade experimental e distribuições de uma única célula não-Gauss, aplicar a normalização quantil por replicar biológica 46. Este processo gera uma distribuição compartilhada entre repetições e permite comparações imparciais sobre mudanças na intensidade immunolabel. Além disso, UNLIKE Z-pontuação e outros métodos paramétricos, normalização quantil é não-paramétrica e não assume uma distribuição particular de dados, permitindo a mais representativa análises de comportamento de uma única célula como uma função da condição vestida. Traçar dados e interpretar. Dependendo do sistema biológico e hipótese, calcular e definir uma ou mais das seguintes medidas do conjunto para cada condição arrayed: Calcular e traçar células por ilha como uma medida combinada da adesão e a sobrevivência durante o decurso da experiência. Calcular e traçar a intensidade immunolabel normalizou-quantil como uma medida de destino ou função celular. Calcular e representar graficamente a percentagem de células positivas para um immunolabel tal como determinado por intensidade superior a um limiar constante, geralmente 2 DP acima da intensidade média de controlo negativo. Alternativamente, as distribuições de enredo de intensidade immunolabel, a fim de examinar e categorizar o comportamento de uma única célulacomo uma função da condição vestida. Essas distribuições podem ainda ser caracterizados utilizando medidas de tendência central (média, mediana, moda) e variação (variância, coeficiente de variação, o fator de Fano) e métodos de teste de hipóteses, tais como o teste de Kolmogorov-Smirnov. Análise de dados TFM. Aqui é descrito um método que incorpora um algoritmo previamente desenvolvido por Butler et ai. e Wang et al. 40, 47. Use ImageJ batch converter as imagens para arquivos TIFF de 8 bits. Aplicar uma média de arrumação de pixel (por exemplo, 2 x 2) para reduzir o custo computacional e o tempo de análise a jusante. Como algoritmos para TFM têm-se centrado principalmente na análise de uma única célula, o grande interface de substrato celular das ilhas (~ 17,5 × 10 3 uM 2) em comparação com a interface de substrato de células de uma única célula (75? M 2) necessiTates o passo binning. Introduza o contraste de fase capturado e imagens fluorescentes vermelhas distantes (ambos pré-dissociação e pós-dissociação) em um ambiente de programação científica, tais como MATLAB e processo usando os algoritmos anteriormente desenvolvidos de Butler et al. e Wang et al. 40, 47. Selecione três regiões distantes da ilha celular. Estas regiões são usadas para explicar os deslocamentos devido à imagem ou deriva da amostra. Fornecer o factor para converter de pixels para micrómetros (por exemplo, pixels 0,454 / iM), o módulo de Young do substrato (por exemplo, 13 kPa), e o coeficiente de Poisson (por exemplo, 0,48 para os geles de poliacrilamida descrito aqui). Para cada ilha, desenhar um limite em torno da periferia para definir as restrições geométricas; todas as forças externas desta fronteira são zerados. Este sistema restrita é razoável dado o grande distance (ou seja, 450 mm) entre as ilhas. Calcular a tensão de tração root mean square eo momento contrátil para cada ilha. O momento contráctil é uma medida da tensão residual em toda a ilha celular e foi mostrado para reflectir a força das interacções célula-célula 48. Para cada condição vestiu, os valores médios de raiz quadrada média mais de múltiplas ilhas e repetições biológicas e calcular associado variância para testes de hipóteses. É também possível calcular a média da distribuição de tensões ou momentos ao longo de muitas ilhas para fornecer um mapa representativo de ambas as medidas como uma função da geometria, por exemplo, a distância a partir do centro da ilha.