Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method

De visualisatie van de individuele neuronen in weefselmonsters maakt het mogelijk om in situ analyse van neuron morfologische kenmerken, die aanzienlijk heeft geavanceerde ons begrip van de hersenen en hoe het kan worden beïnvloed door endogene ziekte of exogene omgevingsfactoren. Het Golgi-Cox kleuringsmethode een kosteneffectief, relatief eenvoudig middels kleuren van een steekproef van neuronen in de hersenen. Eerst ontwikkeld door Golgi ¹ en gewijzigd door Cox ² in de jaren 1800, hebben de onderzoekers verder verfijnd deze techniek door de jaren heen aan duidelijke, goed gekleurde neuronen die kunnen worden gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren zowel dendritische boom morfologie en de wervelkolom dichtheid ^{3, 4} te ^{produceren, 5, 6, 7, 8, 9}.

Een belangrijke technische overweging voor de visualisatie van gekleurde neuronen in hersenen secties de maximale plakdikte, die wordt begrensd door de werkafstand beschikbare sterke vergroting / microscoopobjectieven hoge resolutie. Gemeenschappelijke doelstellingen olie-immersie in de jaren 60 – 100X bereik te bieden uitstekende resolutie, maar worden beperkt door hun werkafstanden die zijn meestal niet groter dan 200 urn. Hersenplakjes gesneden op 200 um bereik kan voldoende zijn om bepaalde types neuron welke op deze plakdikte bijvoorbeeld piramidale neuronen in ondiepe lagen van de hersenschors ^{10, 11, 12,} piramidale neuronen in het CA1-gebied van het visualiseren hippocampus ^{13, 14} en granule cellen in de dentate gyrus van de hippocampus ^15. Neuronen met relatief langeredendritische bomen, zoals piramidale neuronen in diepe lagen van de hersenschors die voor muizen kan meer dan 800 urn uitstrekken vanaf het cellichaam ^16, verschaffen een grotere uitdaging omdat hersenen zou moeten worden doorgesneden op een perfecte hoek met de gehele dendriet structuur bevatten minder dan 200 urn plakjes. Dit kan zelfs onmogelijk zijn als een dendriet of een van de vertakkingen zich uitstrekken in de rostrale en caudale richting. Hoewel het mogelijk is om deze beperking aan te pakken door het traceren van een neuron over meerdere aangrenzende hersenen secties, deze aanpak introduceert een belangrijke technische uitdaging bij de aanpassing van de delen nauwkeurig voor het traceren van ^17. Een meer praktische benadering zou zijn gehele neuronen opgenomen in hersensecties die een grotere dikte worden gesneden visualiseren.

Wij rapporteren hier een techniek om neuronen in 400 vlekken – 500 urn dikke hersenen secties van muizen met behulp van de Golgi-Cox methode, en hun mo visualiserenrphology behulp van een hoge-resolutie siliconenolie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Het Golgi-Cox impregneren en verwerkingsprotocol we beschrijven is gemodificeerd van een van de meest geciteerde moderne protocollen in de literatuur ^6. Onze aanpak dikke hersencoupes verschaft het voordeel van het verhogen van de waarschijnlijkheid van het identificeren neuronen van elke soort die volledig zijn vervat binnen de sectie. Naast de belangrijkste protocol, we ook twee varianten die unieke voordelen verschaffen: (1) Golgi-Cox kleuring met cresyl violet tegenkleuring op het oppervlak gemonteerde secties, teneinde grenzen van hersengebieden te definiëren en lagen van de identiteit cerebrale cortex, en (2) Golgi-Cox kleuring met een tussenproduct bevriezingsstap voor langetermijnopslag geïmpregneerd gehele hersenen vóór snijden en eindverwerking.