Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

La visualización de las neuronas individuales dentro de muestras de tejido permite el análisis in situ de las neuronas características morfológicas, que ha avanzado significativamente nuestra comprensión del cerebro y cómo puede ser influenciado por la enfermedad endógena o factores ambientales exógenas. El método de tinción de Golgi-Cox es un medio rentables, relativamente simples de la tinción de una muestra aleatoria de las neuronas dentro del cerebro. En primer lugar desarrollado por Golgi ¹ y modificado por Cox ² en la década de 1800, los investigadores han perfeccionado esta técnica en los últimos años para producir neuronas claros y bien teñidas con que se pueden utilizar para visualizar y cuantificar tanto la morfología del árbol dendrítico y la densidad de la columna ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Una consideración técnica importante para la visualización de las neuronas teñidas dentro de las secciones del cerebro es el espesor máximo rebanada, que está limitada por la distancia de trabajo de los objetivos disponibles de gran aumento / de alta resolución del microscopio. objetivos de inmersión en aceite comunes en el 60 – 100X gama proporcionan una excelente resolución, pero están limitados por sus distancias de trabajo que son típicamente no mayor de 200 m. Las secciones de cerebro de corte en el rango de 200 micras pueden ser adecuadas para visualizar ciertos tipos de neuronas que pueden estar contenidos dentro de este grosor de corte, por ejemplo las neuronas piramidales en las capas superficiales de la corteza cerebral ^{10, 11, 12,} las neuronas piramidales en la región CA1 de la hipocampo ^{13, 14,} y las células granulares en el giro dentado del hipocampo ^15. Las neuronas con relativamente más largoárboles dendríticos, tales como las neuronas piramidales en las capas profundas de la corteza cerebral que para el ratón se puede extender más de 800 m desde el cuerpo celular ^16, proporcionan un mayor reto porque tendrían que ser seccionada en un ángulo perfecto cerebros para contener todo el árbol de dendritas dentro de los 200 m rodajas. Esto puede incluso no ser factible si una dendrita o cualquiera de sus ramas se extienden en la dirección rostral o caudal. Si bien es posible abordar esta limitación mediante el trazado de una neurona a través de múltiples secciones de cerebro adyacentes, este enfoque presenta un desafío técnico significativo en la alineación de las secciones con precisión para la localización ^17. Un enfoque más práctico sería para visualizar las neuronas enteras contenidas dentro de las secciones del cerebro que se cortan en un espesor mayor.

Presentamos aquí una técnica para teñir las neuronas dentro de 400 – secciones de cerebro de espesor 500 micras de ratones utilizando el método de Golgi-Cox, y para visualizar su morphology usando un silicio objetivo de inmersión en aceite de alta resolución que tiene una distancia de trabajo de 800 m. La impregnación y el procesamiento de protocolo de Golgi-Cox que describimos se modificó a partir de uno de los protocolos modernos más citados en la literatura ^6. Nuestro enfoque con secciones de cerebro de espesor proporciona la ventaja de aumentar la probabilidad de identificar neuronas de cualquier tipo que están contenidos completamente dentro de la sección. Además del protocolo principal, también presentes dos variaciones que proporcionan ventajas únicas: (1) la tinción de Golgi-Cox con la contratinción cresil violeta en la superficie de las secciones montadas, con el fin de definir los límites de las regiones del cerebro y para identificar capas de la corteza cerebral, y (2) tinción de Golgi-Cox con una etapa de congelación intermedio para el almacenamiento a largo plazo de cerebros enteros impregnadas antes de seccionar y el procesamiento final.