Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em> Trichinella</emKas Samples> Larva

1. hazırlıklar Örnek koleksiyon Not: Manyetik karıştırıcı yöntemi, tek veya toplanmış kas örnekleri için kullanılabilir. Uygun tercih sitelerinden ve uygun miktarda 9 örnekleri toplamak. Ülke koşullarına veya ICT, OIE veya ISO tavsiyelerine başvurun. Avrupa Birliği için, örneğin, yerli domuz asma kısmına geçişte bir diyafram ayağı 1 gr örnek almak. Tüm kas örnekleri tüm yağ ve fasya serbest olduğundan emin olun. dil test edilirse, test öncesinde yüzey katmanı kaldırmak. Numuneler donmuş, en Trichinella larva dirençli dondurmak ve ölümden sonra çözülmek değil gibi, özen, sindirime daha az dirençlidir ve azalmış tahlil duyarlılık sonuçlanan konteyner duvarları sopa eğilimindedir. Not: Dondurulmuş ise l numune büyüklüğünü iki katınadoğusunda sedimantasyon süresi (aşağıya bakınız) artırmak. Sindirim sıvısının hazırlanması 3 L'lik bir cam kabın içine 48 ° C – 46 bir ön ısıtmaya tabi musluk suyu 2 L% 25 HCI (16 ± 0.5 mL) ekleyin. eksik sindirim sıcaklık sonuçlarının çok düşük; Bir sıcaklık çok yüksek pepsin enzimatik özellikleri devre dışı bırakır. beher içinde, bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve önceden ısıtılmış bir plaka çözelti karıştırıldı (46-48 ° C). (: 10,000 NF, 1: 12.500 BP, 2000 FIP 1) asidik solüsyona pepsin 10 ± 0.2 g ekleyin. Not: pepsin kalitesi büyük önem ve enzim aktivitesi üretici tarafından tasdik edilmelidir biridir. Laboratuvar Güvenlik nedenlerinden dolayı ve pepsin aktivitesini sürdürmek için, sindirim sıvısı bileşenlerini ekleme sırası bağlı kalınmalıdır. Kas numune hazırlama bir blender veya öğütücü kas numuneleri 100 g kıymak. Blen kolaylaştırmakding, numunelere 2 ml su önceden ısıtılmış ekleyip 2 maksimum hızda uyum – 3 sn. İkinci harmanlama önce, blender açın ve alt ve tekrar karıştırma karıştırma kase kenar marjı üstündeki herhangi bir kas örnek aktarmak. Etin görünür hiçbir parça kalmayıncaya kadar 3 sn – 2 patlamaları ile karıştırma devam edin. Not: Çok az karıştırma eksik sindirim neden olabilir, çok fazla karıştırma örneklerinde 6 Trichinella larva hediyesi zarar verebilir süre. 2. Prosedür Kas örnek sindirim bir silindir içine sindirim sıvısının 1 L aktarın. beher içine kıyma aktarın ve bir kaşık ya da çatalla sindirim sıvısı içinde yaymak. İyice 3 L behere önceden ısıtılmış sindirim sıvısı, 500 mL blender kapağı, bıçak ve blender kase durulayın. Not: Eksik durulama sens kaybına neden olabiliriTivity. alüminyum folyo ile örtün beher ve 44 sabit bir sıcaklıkta tutmak – 46 ° C ve bir termometre ile izleyin. Et parçacıkları kayboluncaya kadar 30 dakika sıçramasına olmadan derin bir girdap oluşturmak için sindirim sıvısı karıştırın. Test et (vahşi hayvanların örneğin et) türüne bağlı olarak, 60 dakika maksimum kadar sindirim süresini uzatır. Filtrasyon ve sindirim sıvısının sedimantasyon sindirilmemiş doku miktarını belirlemek için, sıfır ölçek ayarlamak Kullanmadan önce elek tartmak ve ağırlığını not edin. Elek temiz ve sedimantasyon huni ulaşan Trichinella larvaları engel olabilecek herhangi bir doku parçacıklarının, yoksun olmalıdır. ayırma hunisi dikey tesviye olup olmadığını kontrol edin. Sindirimden sonra, dikkatli bir şekilde ayrılması cam huni içine 180 um'lik bir elekten sindirim sıvısı dökün. Ayırma cam huni genişliği b olmamalıe uzunluğu daha büyük% 55 iyi larva sedimantasyon izin vermek. Herhangi bir taşmasını önlemek için özen gösterin. duyarlılık kaybını önlemek için, iyice cam beher ve bir sıkmak yıkama şişesinden musluk suyu yaklaşık 200 mL elek durulayın ve sedimantasyon cam huni içine durulama suyunu aktarın. dikkatle 3 L beher kenarlarını durulama özen gösterin. elek kaldırın ve iyice elek altındaki alanı durulayın. Sindirilmemiş doku miktarının belirlenmesi Not: Yöntemin uygulanmasında hatalar nedeniyle, kas dokusu iyi fasya ve sindirilemeyen olan bağ dokusu olarak, elek üzerinde kalabilir. sindirilmemiş doku miktarı ilk 10 dakika sedimantasyon adım (2.5 bakınız) sırasında belirlenir. kalıntı su sindirilmemiş doku, belirlenen ağırlığı; etkileyebilir gibi bu elek kuru yaklaşık 30 dakika izin verir. bir ölçekte bir kağıt havlu yerleştirin ve undiges ile elek tartmakted dokular. Sindirilmemiş dokularla elek ağırlığı filtrasyon öncesi elek ağırlığının çıkartılması. Başlangıç numune ağırlığının en fazla% 5'ten elek (örneğin, 5 g / 100 g başlangıç maddesi) üzerinde kalır, eğer bir ayrıştırma işlemi tatmin edici olarak kabul edilmektedir. sindirilmemiş doku miktarı% 5 aşarsa, taze kas örnekleri kullanarak testi tekrarlayın. Kalan doku ağırlıklı sindirilmemiş kas dokusunun oluşması ve taze örnekleri mevcut değildir durumunda, tekrar sindirilmemiş kalıntıları sindirmek ve özgün örneklerin yanı sıra inceler. Sindirim sıvısı sedimantasyon 30 dakika boyunca ayırıcı bir huni içinde filtrelendi sindirim sıvısı tutun. Bozulmamış bırakılırsa, Trichinella larvaları huninin alt kısmında çözecek. Dondurulmuş numuneler kullanıldığında, 60 dakikalık bir maksimum çökelme süresi artar. sedimentasyon tamamlandıktan sonra, tam musluğunu açmakayırma hunisi hızla en az 40 ml sindirim sıvısı izin (kas örnekleri önceden dondurulmuş olsaydı 80 ml) bir ölçüm silindirine kaçıp. İlk olarak, silindir içine sıvının yarısı izin sonra tam geçmek sindirim sıvısının 10 mL izin vermek için ters yönde musluğunu açın. Son olarak, başka bir 10 ml ters yönde musluğunu açın. Bu prosedür Trichinella larvaları musluk içinde sıkışıp olmadığını garanti eder. Not: yeterli hızı, hassasiyeti azalan ayırma hunisi içinde kalan larva önlemek için gereklidir. Silindir sindirim sıvısının sedimantasyon Larvalar çöktürmek için izin vermek için 10 dakika boyunca silindirde tortu bırakın. 10 ml sediment bozmadan bir pipet ile aspirasyon yoluyla 30 ml süpernatantı. numune doku liflerinin miktarını azaltmak için, tortu 30 ml musluk suyu ekleyin ve başka bir 10 m bırakınSıvı berrak hale gelene kadar. tekrarlayın. Süpernatantı ve 10 ml bir ızgarah Petri kabı veya larva sayım havzasına tortuları yıkanmış aktarın. 10 ml musluk suyu ile silindir durulayın ve ardından numune su ekleyin. Not: Gerekirse örnek döküntü olarak büyük miktarlarda Trichinella larvaları (Şekil 1) belirlenmesini önleyebilir, daha yıkama aşamaları, yapılmalıdır. Mikroskobik inceleme Hemen yıkama aşamalarından sonra ve numuneler incelemek için 15 20x büyütmede bir trichinoscope veya ayarlanabilir bir yoğunluk alt aşama iletilen ışık kaynağı olan bir stereo-mikroskop kullanarak. Gridlenmiş Petri kabı içine numune döküldükten sonra, ızgara tarafından çanak / sistematik havza ızgara inceleyin. Hiçbir şüpheli yapılar bulunursa, yavaşça herhangi Trichinella la izin dairesel bir şekilde Gridlenmiş Petri kabı veya larva sayım havzasında sıvıyı taşımakPotansiyel olarak gözardı rvae, Petri kasesinin ortasına birikir. muayene tekrarlayın. Şüpheli bir yapı tespit edilirse, 40 büyütme artırmak – 100X. Bir pipet ile çanak / havzası Trichinella larvaları çıkarın ve% 90 etanol ile bir tüp içine toplayınız. tam çanak incelenmiştir sonra, çanak / havzanın nazik sallayarak başlayarak, prosedürü tekrarlayın. en az üç kez veya daha fazla larva kadar aynı işlemi tekrarlayın bulunur. larvaların sayısını. kas dokusunun miktarına korelasyon test edilmiş ve gram (lpg) başına larva olarak mevcut. çok larvalar güvenilir larva sayısını belirlemek için sindirim sıvısında varsa, ölçüm silindirine larvaları içeren sıvıyı geri dönmek sıkmak yıkama şişesinden musluk suyu ile durulayın ve dibe için larva bırakın. 10 dakika sedimentasyon süresinden sonra, belirli bir hacme süpernatant azaltılması (örneğin10 mL) eklenmiştir. kesin hacmini belirlemek için, bir pipet yardımıyla yeni bir silindirin içine süpernatant aktarın. dinç sallayarak sıvı içinde homojen larvaları Askıya. çalkalama hareketi sırasında, bir Petri kabı üzerine 20 uL, larva süspansiyon 12 damla ekleyin. mikroskopta her damla inceleyin. 240 uL larvaların sayısını belirlemek ve en yüksek ve en düşük sayısını silin. Yüzer toplam hacmine (örneğin 10 mL) larva sayısı tahmin. Not: stereo-mikroskop kalitesi Trichinella larvaların tanımlanması için büyük önem taşımaktadır. Larvalar bir pipetle bir tüp içinde toplanan zaman, larvalar pipet duvara sopa yoktu ama tüpüne aktarılır olduğunu dikkatlice kontrol edin. Not: toplanmış örneklerin Olumlu Trichinella bulguları menşe karkas geri havuzundan takip edilmelidir. Pozitif karkas kimliklerini kadar burada, havuz boyutu giderek azaltılmalıdırtified. Örnek büyüklüğü, duyarlılığı artırmak için, bu işlem sırasında artabilir. ortak bir örnek incelenmesi pozitif ya da belirsiz bir sonuç üretir durumunda, bir 20 gramlık bir numune, her domuz alınır. Beş domuz 20 g numuneleri bir araya getirilmiş ve tarif edilen yöntem kullanılarak incelenmiştir. Bu şekilde beş domuz 20 gruplarından örnekleri incelenecektir. Trichinella beş domuz bir havuza numunede tespit edildiğinde, 20 gr örnekleri grubunda bireysel domuzlar toplanan ve menşe olumlu karkas tespit edilinceye kadar ayrı ayrı incelenir.