Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas
Summary
Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).
Abstract
Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.
Introduction
La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína 1, 2. Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas 3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía 4. Estos métodos son mucho tiempo, deben ser alterados para cada proteína diana, y a menudo resultan en bajos rendimientos. Métodos de purificación modernos implican la fusión de etiquetas peptídicas a proteínas diana, seguido por inmunoprecipitación o extracción en columnas cargadas con perlas unidas a una molécula de captura 5,"> 6. Si bien esto es extensible a muchas proteínas, se requiere modificación de la secuencia de la diana, potencialmente resultando en construcciones que difieren en afinidad por sus parejas de unión habituales. La delicada naturaleza de algunas interacciones proteína-proteína significa este método puede no ser aplicable a muchos escenarios. Además, las pull-down ensayos usados para mapear las interacciones proteína-proteína pueden no capturar una imagen precisa celular, debido a los grados de libertad restringidos y los niveles no nativos de la proteína cebo.
Idealmente, los complejos de proteínas podrían ser detectados en sus estados nativos, sin la necesidad de purificación o pull-down. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) se desarrolló como una alternativa menos desnaturalizante a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y permite la separación de algunas proteínas y complejos de muestras biológicas 7. Sin embargo, las proteínas en BN-PAGE separado basado en un larnúmero ge de variables, incluyendo el tamaño, carga, estructura tridimensional, y la asociación con otras moléculas. Las interacciones de estos factores a menudo resultan en co-separación de proteínas, la formación de agregados, y una pobre resolución banda de proteína. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de dos dimensiones resuelve algunos, pero no todos, de estos problemas 8.
Para evitar las complicaciones asociadas con la separación nativa, algunos autores utilizan reactivos de amina reactiva de reticulación, tales como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar complejos de proteínas en lisados de tejido 4. Estos lisados tratados a continuación, se pueden desnaturalizar y se separaron por SDS-PAGE, mientras que preserva el tamaño nativo y maquillaje de complejos de proteínas. Sin embargo, ya que los reactivos de reticulación reaccionan basa en la proximidad de una molécula a otra, y las proteínas en los lisados de tejido tienen muchos grados de libertad y estocásticamente puede interactuar, cruz fondo no específica-linking puede ser alto, especialmente en muestras concentradas. Esto puede conducir a resultados difíciles de interpretar.
Aquí, demostramos el uso de un método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominado electroforesis en gel de poliacrilamida-multímero (multímero-PAGE), para separar y detectar los conjuntos de proteínas en mezclas complejas. Inicialmente, lisado de células se suspende en gel de poliacrilamida a través de BN-PAGE. El gel que contiene lisado se hace reaccionar luego con el DSP reactivo de reticulación. Pseudo-inmovilizado y ligeramente separadas en el gel, las proteínas son mucho menos propensos a reaccionar de manera no específica, lo que significa reactividad fondo reticulante se reduce. Después de la reticulación, las bandas de gel se extirpan y se separó a través de SDS-PAGE. El gel resultante se puede analizar entonces por cualquier medio típicamente asociados con electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método permite la separación y la detección de complejos de proteínas nativas en lisado de tejido sin modificar, sin la necesidad de purificación adicional o pull-downorte.
Protocol
Representative Results
Discussion
interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad 11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Con el apoyo de la DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos a Bryan A. Killinger para la asistencia técnica con el multímero-página.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
Referenzen
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