Summary

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

Abstract

간은 전신적인 염증 반응의 조절에 결정적인 역할을한다. 특히 만성 신장 질환, 간은 요독, 산화 스트레스, 내 독소 혈증 및 급성기 반응물의 대량 생산으로 염증성 사이토 카인 순환 감소 간격에 응답하여 반응한다. 염증 및 간세포의 기본 역할 실험 도구 연구는 만성 신장 질환으로 특히 복잡한 설정에서 규제와 간 사이토 카인의 기여 전신 급성 위상 응답 및 연장 염증성 시나리오를 이해하기 중요하다. 생체 내에서 염증의 복잡한 메커니즘을 연구하는 것은 도전 남아 있기 때문에, 리소스를 많이 사용하는 보통 및 형질 전환 동물의 사용을 필요로 차 격리 된 간세포는 간 급성 위상 응답으로 기계적인 통찰력을 얻을 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 체외 기술은 적당한 비용을 갖추고 있기 때문에, 높은 재생산성 및 일반적인 기술 지식은 주 절연 간세포 쉽게 스크리닝 방법으로 사용될 수있다. 여기, 우리는 기본 쥐의 간세포를 분리하는 효소 기반의 방법을 설명하고, 우리는 ELISA 및 정량 실시간 PCR을 사용하여 이러한 세포에서 염증 반응의 평가에 대해 설명합니다.

Introduction

만성 신장 질환 (CKD)는 급성 및 만성 염증 (1)의 상태로 정의 될 수있다. CKD 환자에서 phosphaturic 호르몬 섬유 아세포 성장 인자 23 (FGF23)의 혈중 농도가 점진적 혈청 인산염이 항상성을 유지하기 위해 증가. 증가 된 혈청 FGF23 수준은 독립적으로 혈액 투석 치료 3, 4를 시작하는 환자 중 심혈 관계 이환율과 사망률과 연관되어 있습니다. 또한, 여러 임상 연구 상승 FGF23 수준 및 C 반응성 단백질 (CRP), 인터루킨 6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 α (TNFα) (5), (6)의 혈청 레벨 사이의 강한 상관 관계를 보여 주었다. 또한, 실험 연구에서, 우리는 최근에 FGF23 직접 간세포를 대상으로하고 증가 CRP와 IL-6 페이지에 의한 염증 반응을 일으킬 수 있다는 것을 증명하고있다간 7 roduction. 따라서, FGF23는 CKD에 전신 염증에 기여하는 순환 요인으로 작용할 수 있습니다.

70 년대 초, 차 간세포는 고립되었다 처음으로 8 공부했다. 이후 일차 배양 된 간 세포는 광범위하게, 열 처리는 대사 호르몬 기능 약물 대사 및 독성뿐만 아니라 면역 및 염증 반응을 조사 구하는데 사용되어왔다. 이전 프로토콜은 주로 인간 간 조직 (11) (12)로부터 일차 간세포의 효소 격리 설명 하였다. 우수한 모델이지만,이 복합 간 시그널링 메커니즘뿐만 아니라 자극의 종류에 따라 기능적 결과에 미치는 영향을 연구하는 유전자 조작 능력을 남긴다. 이하에서, 우리는 기본 쥐 간세포의 단리를 설명. 특히, 예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS), IL-6와 같은 FGF23 간 급성 단계 반응의 여러 매개체의 효과는 쉽게 빠르고 재현성있는 방법 (13)에 분석 될 수있다.

여기서, 우리는 성체 생쥐에서 간세포의 효소 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 우리는 LPS 및 IL-6과 같은 FGF23 같은 신규 염증성 매개체로서 염증 확립 유도제는 직접 발현 및 분비를 자극 할 수 있음을 입증 이러한 배양 간세포 CRP 및 IL-6과 같은 염증성 사이토킨.

Protocol

모든 동물 프로토콜과 실험 절차는 의학의 마이애미 밀러 학교의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 준비 데우고 간 관류 미디어 간 37 ℃에서 수욕 미디어 다이제스트. 관류 펌프 (30 mL / 분)를 설정합니다. 조심스럽게 간 관류 미디어와 펌프의 배관 시스템을 미리 기입. 시스템의 모든 공기 방울을 피하고 정위 현미경을 준비합니?…

Representative Results

조직학 기본 격리 및 배양 된 세포의 대표적인 광학 현미경 이미지는도 1a에 도시되어있다. 면역 조직 화학적 분석은 절연 간세포 높은 알부민 (적색)뿐만 아니라, 섬유 아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (녹색)을 표현할 수 있음을 보여준다. 핵 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (파란색)로 염색된다. (그림 1B).</s…

Discussion

마우스에서 차 간세포를 분리하면 염증 반응 생체를 연구하는 빠르고, 저렴하고 신뢰할 수있는 도구입니다. 정확하게 수행하면 결과가 쉽게 발생하고, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 재생 될 수있다. 다음 사항을 신중 성공적인 차단을 보장하기 위해 평가되어야한다.

수술 절개와 IVC의 삽관은 전신 마취가 아닌 안락사 후 수행해야합니다. 젊은, 경험이 연구…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH (R01HL128714 CF에) 및 (KS에 F31DK10236101)와 미국 심장 협회 (CF와 AG)에 의해 지원되었다.

Materials

Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer Falcon 352350
BD Insyte Autoguard BD 381412
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators  Puritan 806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 Becton Dickinson 329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style Corning 353003
6 well Cell Culture Cluster Costar 3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) LOOK SP115
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump Gilson F155007
Hemacytometer Kits, Propper VWR 48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper VWR 48300-470
Surgical Scissers – Sharp/Blunt F.S.T. 14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight F.S.T. 14058-11
Dumont SS-45 Forceps F.S.T. 11203-25
Student Tissue Forceps F.S.T. 991121-12
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N Sigma     A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL Piramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) VEDCO     50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL AnaSed Injection 139-236
Willams' Medium E (1x) gibco 12551-032
Liver Perfusion Medium (1x) gibco 17701-038
Liver Digest Medium (1x) Life Technologies 17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements Life Technologies CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements Life Technologies CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 ThermoFisher scientific 10010031
Collagen Type 1 Corning 354236
Trypan Blue Solution VWR 45000-717

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Czaya, B., Singh, S., Yanucil, C., Schramm, K., Faul, C., Grabner, A. Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice. J. Vis. Exp. (121), e55319, doi:10.3791/55319 (2017).

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