Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em> In Vitro</em> Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution 1 geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang – DNA – Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA – Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli – Thioredoxin, die bifunktionellen Primase-Helikase gp4 und die einzelsträngige DNA – Bindungsprotein, GP2. 5) 2. Diese Funktion macht es ein attraktives Modellsystem die konservierten biochemischen Mechanismen der DNA-Replikation beteiligt zu studieren.
Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Bildung von Ribonukleotid Primer durch T7-DNA-Primase platziert, ein critical Schritt bei der Initiation der DNA-Synthese. Darüber hinaus kann man auch die Verwendung dieser Primer durch T7-DNA-Polymerase oder andere Replikationsproteine zu untersuchen, indem sie in der Reaktionsmischung einschließlich. Die T7-Primase-Helikase, gp4, katalysiert die Bildung von Primer für DNA-Synthese an spezifische DNA-Sequenzen Primase-Erkennungsstellen oder PRS genannt, (5'-GTC-3 '). Das Cytosin in der PRS ist kryptisch, es für die Anerkennung der Website von wesentlicher Bedeutung ist, aber es wird nicht in das Produkt 3 kopiert. Der erste Schritt bei der Primersynthese durch gp4 beinhaltet die Bildung des Dinucleotid pppAC, die dann zu einem Trimer verlängert wird, und schließlich zu funktionellen Tetranukleotid Primern pppACCC, pppACCA oder pppACAC Abhängigkeit von der Sequenz in der Template – 4. Diese Primer können dann von T7 DNA – Polymerase verwendet werden , um DNA – Synthese zu initiieren, das auch ein gp4 unterstütztes Verfahren 5, 6. In dieser Hinsicht ist die PrimaseDomäne stabilisiert die extrem kurze tetraribonucleotides mit der Vorlage ihrer Dissoziation zu verhindern, greift DNA – Polymerase tatsächlich in einer Weise , um die Primer / Matrize in der Polymerase – aktiven Stelle 7 sichern. Diese Schritte (RNA-Primer-Synthese, Primer-Handoff-Polymerase und Verlängerung) werden in mehreren Zyklen wiederholt, um die nacheilende Strang zu replizieren und mit der Replikation des führenden Stranges koordiniert werden.
Die Assays hier beschrieben sind, sind sehr empfindlich und kann in einem moderaten Zeitrahmen durchgeführt werden. Sie sind jedoch mit relativ niedrigem Durchsatz und großer Sorgfalt muss bei der Nutzung und Entsorgung von radioaktiven Materialien ausgeübt werden. In Abhängigkeit von der Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft, könnte man ein schnelles Abschrecken Instrument einsetzen, um Proben auf Zeitskalen zugänglich für aussagekräftige Analyse der Kurse Reaktionszeit erreichen entweder die stationäre oder die Pre-stabilen Zustand. Vor kurzem haben wir verwendeten Assays hier beschriebenen evidenc zur Verfügung zu stellene die Bedeutung der Primer Freisetzung aus der Primase-Domäne von gp4 in der Einleitung von Okazaki-Fragmenten. Zusätzlich fanden wir Beweise für eine regulatorische Rolle für die T7 einzelsträngige DNA – Bindungsprotein, gp2.5, bei der Förderung der effizienten Primer Bildung und Nutzung 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM Na…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
Referenzen
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