Leverskade er ledsaget av stamcelleekspansjon som representerer en heterogen cellepopulasjon. Ny klassifisering av denne cellerommet gjør det mulig å skille av flere undergrupper. Metoden som beskrives her illustrerer strømningscytometri-analyse og med høy renhet isolasjon av ulike undergrupper som kan brukes for videre analyser.
I løpet av kroniske leverskader, stamceller ekspandere i en prosess som kalles ductular reaksjon, noe som også medfører forekomsten av inflammatoriske cellulære infiltrat og epitelial celleaktivering. Den stamcelle befolkningen under slike betennelsesreaksjoner har hovedsakelig blitt undersøkt ved hjelp av enkle overflatemarkører, enten ved histologisk analyse eller ved flowcytometri-baserte teknikker. Men nye overflatemarkører identifisert ulike funksjonelt distinkte undergrupper innenfor leveren stamfar / stamcellerommet. Metoden som presenteres her beskriver isolering og detaljert flyt cytometri analyse av progenitor undergrupper ved hjelp av ny overflatemarkør kombinasjoner. Videre viser det hvordan de ulike stamcelle undergrupper kan isoleres med høy renhet ved hjelp av automatisert magnetisk og FACS sortering-baserte metoder. Viktigere, ny og forenklet enzymatisk dissosiasjon av leveren gjør det mulig for isolering av disse sjeldne cellepopulasjoner med en høy levedyktighetsom er overlegen i forhold til andre eksisterende metoder. Dette er spesielt aktuelt for ytterligere å studere stamceller in vitro, eller for isolering av høy kvalitet RNA for å analysere genekspresjon profilen.
Leveren regenerering er hovedsakelig knyttet til selvfornyelse kapasitet på hepatocytter. Ikke desto mindre forekommer kroniske leverskader med stamcelle aktivering og ekspansjon, som er blitt forbundet med deres evne til å differensiere til hepatocytter og cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Dette er spesielt relevant fordi, i løpet av kroniske skader, er hepatocytter spredning ikke er effektive. Til tross for flere genetiske Tracing studier rettet mot stamceller, deres rolle i leveren regenerering er fortsatt kontroversielt 5, 6, 7, 8. Videre har aktiveringen av progenitorceller vært knyttet til økt fibrotisk reaksjon i leveren, noe som stiller spørsmål om deres eksakte rolle under skader 9, 10.
Den heterogene natur av stamcelle kammeret har lenge vært foreslått av genuttrykkstudier det isolerte progenitor-celler som uttrykker et enkelt overflatemarkør ved hjelp av mikrodisseksjon eller cellesortering-baserte metoder 1, 11. Faktisk nylig en ny overflate markør kombinasjon hjelp gp38 (podoplanin) utvetydig knyttes tidligere enkeltmarkører stamceller til ulike undergrupper 12. Viktigere, disse undergrupper ikke bare skilte seg i deres overflate markør uttrykk, men også utstilt funksjonelle endringer i løpet av skader 12.
Flere dyremodeller er blitt benyttet for å undersøke progenitor-celleaktivering og leveren regenerering. Det virker som de ulike skadetyper fremme aktivering av ulike undergrupper av stamceller 12. Dette kan forklare phenotypic divergens av ductular reaksjon er observert hos mennesker 4. Dermed komplekse fenotypiske og funksjonelle analyser av stamceller er avgjørende for å forstå sin rolle i skader og den sanne betydningen av ductular reaksjon i leversykdommer.
Foruten overflate markør kombinasjoner, de avgjørende forskjeller i celle isolasjon protokoller ytterligere komplisere konklusjonene basert på tidligere studier 2. En betydelig mengde av studier rettet rollen til stamceller som i stor grad har forskjellig isolasjonsprotokoll (f.eks lever dissosiasjon (enzymkombinasjon og varigheten av prosessen), tetthet medium og sentrifugehastighet) 2. En optimalisert isolert teknikk, noe som gir bedre levedyktighet for sjeldne celle populasjoner og reflekterende av undergruppe sammensetning, har blitt utviklet og utgitt nylig 12. Målet med denne artikkelen er å gi en mer Fondetfeilte protokoll fra denne levercelleisoleringsprosedyren og den undergruppe analyse for å tillate riktig gjengivelse av teknikken. I tillegg omfatter protokoll en sammenligning med den tidligere isolasjonsmetoden for å vise forskjellene i forhold til den nye protokoll.
Leverbetennelse og skader av ulik opprinnelse utløse regenerative prosesser i leveren som er ledsaget av stamcelleekspansjon og aktivering to, tre. Disse lever stamceller har stamcelleegenskaper og sannsynligvis spille en betydelig rolle i pathomechanism av ulike leversykdommer.
Heterogeniteten av lever progenitorceller har lenge vært foreslått. Den revurdering av lever progenitor undergrupper ved hjelp av en ny overflate markør …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation Sofja Kovalevskaja Award til VLK.
RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |