Summary

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

Published: February 18, 2017
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Summary

肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。

Abstract

慢性肝臓傷害の間、前駆細胞は、炎症性細胞浸潤および上皮細胞の活性化の出現を伴う小管反応と呼ばれるプロセスで展開します。そのような炎症反応中に前駆細胞集団は、大部分の組織学的分析によって、またはフローサイトメトリーベースの技術のいずれかによって、単一の表面マーカーを使用して研究されています。しかしながら、新規な表面マーカーは、細胞コンパートメント幹/肝前駆細胞内の種々の機能的に異なるサブセットを同定しました。ここで紹介する方法は、新規の表面マーカーの組み合わせを使用して、前駆細胞サブセットの分析サイトメトリー分離と詳細な流れを説明しています。また、種々の前駆細胞のサブセットは、自動磁気及びFACSソーティングに基づく方法を用いて高純度で単離することができる方法を示します。重要なことは、小説や肝臓の単純化された酵素的解離は高い生存率これらの希少な細胞集団の単離を可能にしますそれは、他の既存の方法に比べて優れています。これは、さらに、インビトロで前駆細胞を研究するため、または遺伝子発現プロファイルを分析するために、高品質のRNAを単離するために特に適切です。

Introduction

肝臓再生は、主に肝細胞の自己再生能と関連しています。それにもかかわらず、慢性肝損傷は、肝細胞及び胆管1、2、3、4に分化する能力と関連している前駆細胞の活性化および拡大で起こります。慢性傷害の間、肝細胞増殖が有効でない場合、これは特に重要です。前駆細胞を標的とする多数の遺伝的追跡研究にもかかわらず、肝臓再生におけるそれらの役割は、5、6、7、8議論の余地。また、前駆細胞の活性化は、負傷9の間にそれらの正確な役割について疑問を提起肝臓で増加した線維化反応、にリンクされています、10。

前駆細胞コンパートメントの不均一な性質は、長い顕微解剖または細胞選別に基づく方法1、11使用して単一表面マーカーを発現する前駆細胞を単離し、遺伝子発現研究によって示唆されています。実際、最近、GP38(ポドプラニン)を使用して、新規な表面マーカーの組み合わせは明確種々のサブセット12に前駆細胞の前の単一のマーカーを結合されました。重要なことは、これらのサブセットは、それらの表面マーカー発現が異なるだけでなく、怪我12の間に機能的変化を示しただけではなく。

多数の動物モデルは、前駆細胞の活性化及び肝再生を研究するために利用されています。様々な損傷の種類は、前駆細胞12の異なるサブセットの活性化を促進すると思われます。これは、pHを説明するかもしれません人間4で観察された小管反応のenotypic発散。このように、前駆細胞の複雑な表現型および機能解析は、怪我や肝疾患における小管反応の真の意義における役割を理解することが極めて重要です。

表面マーカーの組み合わせの他に、細胞単離プロトコールにおける重要な違いは、さらに、以前の研究2に基づいて結論を複雑にします。研究のかなりの量が大きく、それらの単離プロトコルが異なる前駆細胞( 例えば、肝臓解離(酵素の組み合わせと処理の持続時間)、密度媒体、及び遠心分離スピード)の役割に対処2。希少な細胞集団とサブセットの組成物の反射のためのより良い生存可能性を提供する最適化された分離技術は、開発され、最近12公開されています。この記事の目的は、より多くのDETを提供することです技術の適切な再現を可能にするために、この肝細胞の単離手順およびサブセット解析のプロトコルをailed。さらに、プロトコルは、新しいプロトコルと比較して違いを示すために、以前の分離法との比較を含んでいます。

Protocol

全ての実験手順は、ホンブルク大学医療センターの倫理や動物管理委員会の承認を得て行きました。 材料およびバッファの作製たての細菌汚染を避けるために、無菌のコンポーネントと層流フードを使用して、肝臓の消化のために必要なすべてのバッファを準備します。 1%(v / v)の溶液を達成するために、RPMI培地49.5 mLおよびウシ胎児血清(低エンドト…

Representative Results

実質及び非実質肝細胞( 図1および図2A)を含む単一細胞懸濁液中の酵素の結果の新規な混合物を使用して、肝臓の消化のためにここに提示手順。赤血球のACK-溶解後、単一細胞懸濁液の分析サイトメトリー直接流れが( 図1及び2)が可能です。ゲーティング戦略はダブレットと死細胞( 図2a)の排除を伴?…

Discussion

肝臓の炎症と異なる起源の損傷は、前駆細胞の増殖および活性化2、3を伴う肝臓での再生プロセスをトリガーします。これらの肝前駆細胞は、細胞性幹有し、おそらく、様々な肝疾患の病理学的機序において重要な役割を果たす。

肝臓前駆細胞の不均一性は、長い間示唆されています。異なる表面マーカーを運ぶサブセットを?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、VLKにアレクサンダー・フォン・フンボルト財団Sofja Kovalevskaja賞によってサポートされていました。

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

Referenzen

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

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Diesen Artikel zitieren
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

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