अलगाव और लिवर पूर्वज उपसमुच्चय एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन द्वारा की पहचान की संवर्धन
Summary
लिवर चोटों पूर्वज सेल विस्तार है कि एक विषम सेल की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है के साथ कर रहे। इस सेलुलर डिब्बे के उपन्यास वर्गीकरण कई कैंपेन्स के लिए भेद की अनुमति देता है। विधि यहाँ वर्णित विश्लेषण और विभिन्न सबसेट है कि आगे assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की उच्च शुद्धता अलगाव प्रवाह cytometry को दिखाता है।
Abstract
जीर्ण जिगर की चोटों के दौरान, पूर्वज कोशिकाओं एक प्रक्रिया ductular प्रतिक्रिया कहा जाता है, जो भी भड़काऊ सेलुलर घुसपैठ और उपकला सेल सक्रियण की उपस्थिति पर जोर देता में विस्तार। इस तरह के भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान पूर्वज सेल की आबादी ज्यादातर एकल सतह मार्कर का उपयोग कर जांच की गई है, या तो ऊतकीय विश्लेषण द्वारा या प्रवाह cytometry आधारित तकनीक से। हालांकि, उपन्यास सतह मार्कर जिगर पूर्वज के भीतर विभिन्न कार्यात्मक अलग कैंपेन्स पहचान / सेल डिब्बे स्टेम। यहाँ प्रस्तुत विधि अलगाव और उपन्यास सतह मार्कर संयोजन का उपयोग कर पूर्वज कैंपेन्स के cytometry विश्लेषण विस्तृत प्रवाह का वर्णन है। इसके अलावा, यह दर्शाता है कि कैसे विभिन्न पूर्वज सेल सबसेट उच्च शुद्धता का उपयोग कर चुंबकीय स्वचालित और FACS छँटाई आधारित विधियों के साथ अलग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, जिगर के उपन्यास और सरल एंजाइमी हदबंदी एक उच्च व्यवहार्यता के साथ इन दुर्लभ सेल आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देता हैकि अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में बेहतर है। यह आगे इन विट्रो में पूर्वज कोशिकाओं के अध्ययन के लिए या उच्च गुणवत्ता शाही सेना को अलग-थलग जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।
Introduction
लिवर उत्थान ज्यादातर hepatocytes की आत्म नवीकरण क्षमता के साथ जुड़ा हुआ है। फिर भी, जीर्ण जिगर की चोटों पूर्वज सेल सक्रियण और विस्तार है, जो hepatocytes और cholangiocytes 1, 2, 3, 4 में अंतर करने की क्षमता के साथ संबद्ध किया गया है साथ होते हैं। यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि पुरानी चोट के दौरान, hepatocyte प्रसार प्रभावी नहीं है। कई आनुवंशिक ट्रेसिंग पूर्वज कोशिकाओं को निशाना अध्ययनों के बावजूद, जिगर उत्थान में उनकी भूमिका विवादास्पद 5, 6, 7, 8 बनी हुई है। इसके अलावा, पूर्वज कोशिकाओं की सक्रियता जिगर में वृद्धि हुई fibrotic प्रतिक्रिया है, जो चोटों 9 के दौरान अपनी सटीक भूमिका के बारे में सवाल उठता से जोड़ा गया है10।
पूर्वज सेल डिब्बे की विषम प्रकृति लंबे जीन अभिव्यक्ति अध्ययन है कि पूर्वज कोशिकाओं एक भी सतह मार्कर व्यक्त microdissection या सेल छँटाई आधारित विधियों 1, 11 का उपयोग कर अलग से सुझाव दिया गया है। दरअसल, हाल ही में, एक उपन्यास सतह मार्कर संयोजन का उपयोग कर gp38 (podoplanin) स्पष्ट पूर्वज कोशिकाओं के पिछले एक मार्कर के विभिन्न सबसेट 12 से जुड़ा हुआ है। महत्वपूर्ण बात है, इन कैंपेन्स ही उनकी सतह मार्कर अभिव्यक्ति में मतभेद नहीं है लेकिन यह भी चोटों के 12 के दौरान कार्यात्मक परिवर्तन का प्रदर्शन किया।
एकाधिक पशु मॉडल पूर्वज सेल सक्रियण और जिगर उत्थान जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। ऐसा लगता है कि विभिन्न प्रकार के चोट के पूर्वज कोशिकाओं 12 के सबसेट भिन्न की सक्रियता को बढ़ावा देने के। यह पीएच व्याख्या हो सकती हैमनुष्य 4 में मनाया ductular प्रतिक्रिया के enotypic विचलन। इस प्रकार, पूर्वज कोशिकाओं के जटिल प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण चोटों में उनकी भूमिका और यकृत रोगों में ductular प्रतिक्रिया का असली महत्व को समझने के लिए निर्णायक हैं।
सतह मार्कर संयोजन इसके अलावा, सेल अलगाव प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण मतभेद आगे पिछले अध्ययनों के आधार पर निष्कर्ष 2 को मुश्किल। अध्ययन का एक पर्याप्त राशि पूर्वज कोशिकाओं है कि बहुत से उनके अलगाव प्रोटोकॉल में मतभेद है (जैसे, जिगर हदबंदी (एंजाइम संयोजन और प्रक्रिया की अवधि), घनत्व मध्यम, और centrifugation गति) की भूमिका को संबोधित 2। एक अनुकूलित अलगाव तकनीक, दुर्लभ सेल आबादी के लिए बेहतर व्यवहार्यता प्रदान करने और सबसेट रचना को प्रतिबिंबित करता है, विकसित और हाल ही में 12 प्रकाशित किया गया है। इस लेख का उद्देश्य एक अधिक Det प्रदान करने के लिए हैइस जिगर सेल अलगाव की प्रक्रिया और सबसेट विश्लेषण के ailed प्रोटोकॉल तकनीक के समुचित प्रजनन के लिए अनुमति देने के लिए। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल नए प्रोटोकॉल की तुलना में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए पिछले अलगाव विधि के साथ एक तुलना भी शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जिगर में सूजन और अलग मूल की चोट जिगर कि पूर्वज सेल विस्तार और सक्रियण 2, 3 के साथ कर रहे में पुनर्योजी प्रक्रियाओं को ट्रिगर। ये जिगर पूर्वज कोशिकाओं सेल स्टेम विशेषताओं के अधिकारी…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए VLK अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन Sofja Kovalevskaja पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
Referenzen
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