Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel
Summary
lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.
Abstract
Pendant les blessures chroniques du foie, les cellules progénitrices se développer dans un processus appelé réaction canalaire, ce qui implique également l'apparition de infiltrat cellulaire inflammatoire et l'activation des cellules épithéliales. La population de cellules souches au cours de telles réactions inflammatoires a surtout été étudié en utilisant des marqueurs de surface uniques, soit par une analyse histologique ou par des techniques à base de cytométrie en flux. Cependant, de nouveaux marqueurs de surface identifiés divers sous-ensembles fonctionnellement distinctes au sein de l'ancêtre du foie / tige compartiment cellulaire. La méthode présentée ici décrit l'isolement et organigramme détaillé cytométrie analyse des sous-ensembles progénitrices en utilisant des combinaisons de marqueurs roman de surface. En outre, il montre comment les différents sous-ensembles de cellules progénitrices peuvent être isolés par des méthodes de tri de haute pureté en utilisant automatisé magnétique et FACS. Surtout, nouveau et simplifié dissociation enzymatique du foie permet l'isolement de ces populations de cellules rares avec une viabilité élevéequi est supérieure en comparaison avec d'autres méthodes existantes. Ceci est particulièrement pertinent pour étudier davantage les cellules progénitrices in vitro ou pour l' isolement de l' ARN de haute qualité pour analyser le profil d'expression génique.
Introduction
La régénération hépatique est principalement associée à la capacité d'auto-renouvellement des hépatocytes. Néanmoins, les lésions chroniques du foie se produisent avec l' activation des cellules progénitrices et l' expansion, qui ont été associés à leur capacité à se différencier en hépatocytes et cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Ceci est particulièrement pertinent parce que, au cours des blessures chroniques, la prolifération des hépatocytes est pas efficace. En dépit de nombreuses études de traçage génétique ciblant les cellules souches, leur rôle dans la régénération du foie reste controversée 5, 6, 7, 8. En outre, l'activation des cellules progénitrices a été liée à une augmentation de la réponse fibrotique dans le foie, ce qui soulève des questions quant à leur rôle exact pendant 9 blessures, 10.
Le caractère hétérogène du compartiment de cellules progénitrices a longtemps été suggérée par des études d'expression génique , qui isole des cellules progénitrices exprimant un marqueur de surface unique en utilisant une microdissection ou une cellule méthodes basées sur le tri 1, 11. En effet, tout récemment, une nouvelle combinaison de marqueurs de surface à l' aide gp38 (podoplanin) lié sans équivoque des marqueurs individuels précédents de progéniteurs de 12 différents sous – ensembles. Surtout, ces sous – ensembles non seulement diffèrent par leur expression de marqueurs de surface , mais aussi présentaient des altérations fonctionnelles pendant 12 blessures.
Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour étudier l'activation des cellules progénitrices et la régénération du foie. Il semble que les différents types de blessures favorisent l'activation des sous – ensembles de cellules souches 12 différentes. Cela pourrait expliquer le phdivergence enotypic de la réaction ductulaire observée chez les humains 4. Ainsi, les analyses phénotypiques et fonctionnels complexes de cellules progénitrices sont essentiels pour comprendre leur rôle dans les blessures et la vraie signification de la réaction canalaire dans les maladies du foie.
Outre les combinaisons de marqueurs de surface, les différences cruciales dans les protocoles d'isolement de cellules compliquent encore davantage les conclusions fondées sur des études antérieures 2. Une quantité importante d'études a évoqué le rôle des cellules progénitrices qui diffèrent grandement dans leur protocole d'isolement (par exemple, la dissociation du foie (combinaison de l' enzyme et la durée du processus), de densité moyenne, et la vitesse de centrifugation) 2. Une technique d'isolation optimisée, offrant une meilleure viabilité des populations de cellules rares et de réflexion de la composition du sous – ensemble, a été développé et publié récemment 12. Le but de cet article est de fournir un plus detailed protocole de la procédure d'isolement des cellules du foie et de l'analyse du sous-ensemble pour permettre une bonne reproduction de la technique. En outre, le protocole comprend une comparaison avec la méthode d'isolement préalable pour démontrer les différences par rapport au nouveau protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflammation du foie et des blessures de différentes origines déclenchent les processus de régénération du foie qui sont accompagnés par l' expansion des cellules progénitrices et activation 2, 3. Ces cellules progénitrices hépatiques possèdent souches caractéristiques cellulaires et jouent probablement un rôle important dans le mécanisme pathogénique de diverses maladies du foie.
L'hétérogénéité des progé…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Sofja Kovalevskaja Award Alexander von Humboldt à VLK.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
Referenzen
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
