JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Immunologie und Infektion

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

Published: April 19, 2017
doi:
10.3791/55283
, , , , ,
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute,University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute,University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology,University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital,University of Oxford

Summary

Dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for måling av alloreaktiviteten i en blandet populasjon av T-celler ved hjelp av avbildning flowcytometri.

Abstract

Målingen av immunologiske reaktiviteten til donorantigener hos transplantasjonspasienter er sannsynlig å være avgjørende for en vellykket reduksjon eller tilbaketrekking av immunsuppresjon. Den blandede leukocyttkultur-reaksjon (MLR), begrensende fortynning analyser, og trans-vivo-forsinket-type hypersensitivitet (DTH) assay har alle blitt anvendt på dette spørsmålet, men disse metodene har begrenset prediktiv evne og / eller betydelige praktiske begrensninger som reduserer deres anvendelighet. Imaging flowcytometri er en teknikk som kombinerer de multiparametrisk kvantitative krefter flowcytometri med bildekapasiteten fluorescerende mikroskopi. Vi har nylig gjort bruk av en billeddannende flow-cytometri for å definere andelen av mottaker-T-celler som er i stand til å danne modne immun synapser med donor antigenpresenterende celler (APC). Ved hjelp av en velkarakterisert mus hjertetransplantasjonsmodellen har vi vist at hyppigheten av in vitro-immun synapser blant T-APC Membrane kontaktopprettelser sterkt forutsagt allograft resultere i avvisning, toleranse, og en situasjon hvor transplantasjon overlevelse avhenger av induserte regulatoriske T-celler. Frekvensen av T-APC kontaktene økes med T-celler fra mus i løpet av akutt avvisning og redusert med T-celler fra mus som er ytet svarer til alloantigen. Tilsetning av regulatoriske T-celler til in vitro-system redusert lengre T-APC kontakter. Kritisk, denne effekten ble også observert med humant polyklonalt ekspandert, naturlig forekommende regulatoriske T-celler, som er kjent for å kontrollere avvisning av humane vev i humanisert musemodeller. En videreutvikling av denne metode kan tillate en dypere karakterisering av alloreaktive T-celleavdeling i organtransplanterte pasienter. I fremtiden kan videre utvikling og evaluering av denne metode under anvendelse av humane celler som danner grunnlaget for analysene som benyttes for å velge pasienter for immunsuppresjon minimalisering, og den kan brukes til å måle virkningen av tolerogenic therapies i klinikken.

Introduction

Organtransplantasjon har transformert behandling av pasienter med sluttstadiet sykdommer i nyre, lever, hjerte og lunger. På grunn av forskjeller i større og mindre histokompatibilitetsantigener, imidlertid, allotransplantater straks blir avvist av mottaker-T-celler hvis immunosuppressive legemidler ikke er brukt. Disse agentene har mange skadevirkninger, herunder risiko for kreft og organdysfunksjon. En vesentlig klinisk mål er derfor å redusere dosen av immunsuppresjon til det minimumsnivået som kreves for å forhindre allograft-avvisning. Dette nivået er sannsynligvis vil variere avhengig av graden av aktivering av den medfødte immunsystemet; graden av donor-mottaker alloantigen mismatch; og inter-pasient forskjeller i immunfunksjon, farmakokinetikk og farmakodynamikk.

Dessverre har transplanterte klinikere ikke har noen verktøy for nøyaktig å vurdere donor reaktivitet hos enkelte pasienter 1. den blandedeleukocytt-reaksjon (MLR) kan detektere donor reaktivitet, men den ikke på en pålitelig måte å forutsi utfallet pode 2, 3. Begrensende fortynning analyser, cytokin-ELISPOTs og trans-vivo-analyse enten måle et begrenset utvalg av svar eller ikke er praktisk 4, 5, 6, 7, 8 .Gene ekspresjonsprofiler har avdekket signaturer knyttet til driftsmessige toleranse 9, 10, 11, 12 og avvisning 13, 14, 15, men disse er ikke alltid generaliseres på tvers av populasjoner 16 og kan til slutt har begrenset anvendelighet i den enkelte pasient. Sekvens-baserte analyses av T-cellereseptoren (TCR) av T-celler i perifert blod 17 eller prolifererende i MLR-18 er også blitt utviklet, men krever ytterligere validering.

Begrepsmessig vil det være ønskelig å ha en metode som påviser de tidligste nødvendige grep på mottaker-T-celleaktivering ved en donor antigen. Ettersom oppdyrking-celler over flere dager (som i MLR) kan innføre gjenstander, vil en slik test ideelt sett ikke krever måling av nedstrøms hendelser, for eksempel proliferasjon eller effektorfunksjon. På samme måte vil det imidlertid også være ønskelig for at testen skal være avhengig av et element av T-cellefunksjon, ettersom rent beskrivende vurderinger (For eksempel, TCR-sekvensering) kan være ute av stand til å skille mellom anergiske og funksjonelle T-celler.

Tallrike studier har indikert at langvarig T-APC kontakt er nødvendig for dannelsen av en immun synapse, som er et viktig førsttrinn i T-celle-respons 19, 20, 21, 22. Vi har nylig rapportert at under dynamisk in vitro tidsforløp avbildning, ca. 5 – 10% av mus CD4 + T-cellene danner langvarige kontakt med allogen benmarg-avledede dendrittceller (BMDCs) 23. Frekvensen av langvarig kontakt ble øket hos dyr som forkastet en pode, mens i mus som på forhånd gjort tolerante overfor de samme antigenene, det holdt seg på nivået i untransplanted mus 23. Forlenget interaksjoner ble redusert i nærvær av mottakeren Tregs og økt i deres fravær, og vi har observert lignende fenomener ved hjelp av humane T-celler og allogene moncyttavledede DC (MoDCs) 23.

Imidlertid opptellingen av langvarig kontakt foretas innenfor et polyklonalt T-celle population er tidkrevende og arbeidskrevende. Vi har derfor gjort bruk av avbildnings flow-cytometri for å undersøke allogent immun synapse formasjon. Imaging flowcytometri inkorporerer den multiparametrisk datainnsamling og analyse av konvensjonell flowcytometri med enkeltcelle avbildnings evner av fluorescens mikroskopi. Denne teknikken har blitt brukt av andre forskere for å studere immun synapse dannelse av monoklonale T-celler 24, 26, 27 eller i nærvær av superantigener 28. I slike innstillinger, men frekvensen av responderende T-celler ligger i området 30-100%, mens alloreaktive T-celler er generelt anslått til 5-15% av den totale T-cellerepertoaret 29, 30, 31, 32. Viktigere, viste vi at bilde flowcytometri kan produsere averi sammenlignbare mål på alloreaktive T-celle-frekvens 23 og at endringer i synapse frekvens innenfor et polyklonalt T-cellepopulasjon som er prediktive for pode utfall 23. Foreløpig har denne tilnærmingen er optimalisert for å måle direkte alloreaktiviteten av CD4 + T-celler, men i prinsippet kan det også bli utviklet for å undersøke CD8 + T-celler og den indirekte veien. Indirekte alloreaktiviteten antas å bli mer og mer aktuelt ved lengre tidspunkter etter transplantasjon 33. Vi utvikler denne metode for å bruke humane celler, som vil tillate for testing i pasienter. Således, i fremtiden, kan den generelle tilnærmingen være nyttige for funksjonell vurdering av T-celle-responser hos transplantasjonspasienter før transplantasjon; umiddelbart etter transplantasjon; og på lang sikt, når stoffet minimering blir et viktig mål.

Protocol

1. Forbered Reagenser og materialer som kreves Forbered fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) ( "vaskebuffer"). Fremstill PBS med 2% FCS inneholdende 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel ( "perm-vaskebuffer"; se tabell of Materials). Fremstill PBS med 1,5% formaldehyd. MERK: OBS! Formaldehyd er etsende og potensielt kreftfremkallende og må håndteres mens iført egnet personlig verneutstyr. Fremstill PBS inneholdende 2% FBS og 0,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) for magnetisk celleseparasjon ( "MCS-buffer"). Forbered 50 mikrogram / ml phalloidin-fluorescein-isotiocyanat (FITC-Phalloidin) i dimetylsulfoksyd (DMSO). Fremstill en 1 mg / ml kjernefarge (for eksempel 1 mg / ml 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) i DMSO eller bis-benzimid fargestoff, se tabell of Materials) i DMSO. Forbered fluorokromkonjugerte merkede antistoffer egnet for cellene av interesse ogavbildnings strømningscytometer. Oppnå animalsk vev (f.eks, lymfeknuter og milt) som en kilde for T-celler og allogen animalsk vev (f.eks, milt og benmarg) som en kilde til antigenpresenterende celler eller forløpere. Forbered cellekulturmedium (f.eks, Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640 eller Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% FBS), 50 uM 2-merkaptoetanol, penicillin og streptomycin og oppnå 24- og / eller 96- brønn cellekulturplater. 2. Fremstill antigenpresenterende celler MERK: I teorien kan noen APC befolkningen bli undersøkt med denne metoden. Umodne mus benmarg-avledede dendrittceller (DCS) som APC ble økte har i dette tilfellet. Mange protokoller eksisterer for generering av disse cellene (for eksempel, referanser 34 og 35). I korte trekk ble den følgende protokoll benyttet. Flush marg fra lårben og skinnebein i RPMI 1640 eller DMEM. Passere de suspenderte cellene gjennom et 70 mikrometer celle sil for å fjerne små stykker av bein og rusk. Sentrifuger cellene ved sentrifugering og deretter å lysere røde blodceller ved anvendelse av et ammonium-klorid-buffer i 5 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger cellene ved sentrifugering (400 x g, 5 min) og cellepelleten suspenderes. Vask cellene i 5 – 10 ml vaskebuffer, pellet ved sentrifugering (400 x g, 5 min), og re-suspen cellepelleten. Berike hematopoetiske forløpere mer enn en celleseparasjonskolonne ved merking av cellene med biotinylert anti-CD3 (5 ug / ml), anti-B220 (5 ug / ml), anti-MHC klasse II (1 pg / ml), og anti-CD11b (5 ug / ml) antistoffer. Sentrifuger cellene ved sentrifugering (400 x g, 5 min) og re-suspen cellepelleten. Cellene inkuberes med anti-biotin-magnetiske mikrokuler (se tabell of Materials) ved 4 ° C i 10 min. Vask og sentrifuger cellene (400 x g, 5 min) og re-suspend dem i 1 ml av MCS-buffer før fjerning av de merkede celler ved anvendelse av et stort utvalg positiv (LS) magnetisk celleseparasjonskolonne preparert med 3 ml av MCS-buffer og plassert i dens magnet. Vask kolonnen med 3 x 3 ml av MCS-buffer; gjennomstrømnings vil inneholde de ønskede cellene. Dyrke cellene som passerer gjennom kolonnen i 6 dager i RPMI 1640 eller DMEM supplert med 2 ng / ml rekombinant muse granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og 2 ng / ml av rekombinant human transformerende vekstfaktor β1 (TGFβ1) . Erstatte halvparten av medium hver 2. dag med friskt komplett medium som inneholdt 2 ng / mL GM-CSF og TGFβ1. MERK: Human TGFβ1 har aktivitet i museceller. Dataene er generert ved hjelp av disse umodne DC. Andre celler (for eksempel B-celler og modne DC) kan være egnet som APC-er, men har ikke blitt testet i denne analysen. Cryopreservere DC i 90% serum / 10% DMSO og oppbevar i flytende nitrogen; oppgangden dag i bruk. Før bruk telle antallet levedyktige DC i et hemocytometer ved hjelp av trypanblått-utelukkelse. * Resuspender cellepelleten i kulturmediet ved passende tetthet (se trinn 4.1) før bruk i punkt 4. 3. Fremstill t-cellene Bruk negative seleksjonsmetoder for å unngå utilsiktet overføring av aktiverende eller inhiberende signaler til cellene. NB: I dette eksemplet er CD4 + T-celler preparert for analyse. For å fremstille CD4 + T-celler fra musemilt, mos milten gjennom et 70-mikrometer celle sil ved hjelp av stempelet i en sprøyte. Vask cellefilter med vaskebuffer. Pellet de suspenderte cellene ved sentrifugering (400 x g, 5 min) og deretter å lysere de røde blodlegemer ved å re-suspendering av pelleten i en ammoniumklorid-buffer i 5 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger cellene ved sentrifugering (400 x g, 5 min) og resuspendere pelleten. Vask cellens i 5 – 10 ml vaskebuffer, og pellet ved sentrifugering (400 x g, 5 min). Re-suspendere pellet. Flekk cellene med biotinylerte antistoffer til CD8, store histokompatibilitetskompleks klasse II (MHC II, 1 ug / ml) og CD19 (5 ug / ml). Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C. Vask cellene i 10 ml vaskebuffer, og pellet ved sentrifugering (400 x g, 5 min). Re-suspendere pellet. Cellene inkuberes med anti-biotin-magnetiske mikrokuler (se tabell of Materials) i henhold til produsentens anvisninger. Vask cellene i 10 ml vaskebuffer, og pellet ved sentrifugering (400 x g, 5 minutter); re-suspendere pellet. * Resuspender cellene i 1 ml av MCS-buffer og berike CD4 + T-celler i løpet av en magnetisk celleseparasjonskolonne preparert med 3 ml av MCS-buffer på en magnet. Vask kolonnen med 3 x 3 ml av MCS-buffer. Kolonne gjennomstrømning vil inneholde de anrikede T-celler. Ved standard flyt cytomeprøve, evaluere T-celle-renhet ved anvendelse av en alikvot av de negativt utvalgte celler. Flekk-celler ved bruk av et fluorokrom-streptavidin-konjugat (for å identifisere eventuelle biotin-merkede celler som skulle ha vært fjernet på kolonnen), og et antistoff eller antistoffer for å identifisere T-cellepopulasjonen av interesse (CD4 i dette tilfellet); en renhet på ≥85% er akseptabelt 23. Telle T-celler i et hemocytometer ved trypanblått-eksklusjon (≥90% levedyktighet er akseptabelt). MERK: MCS bufferen inneholder EDTA, som må fjernes forut for analyse. For å oppnå dette, sentrifuger cellene ved sentrifugering (400 x g, 5 min) og vask i 1 ml vaskebuffer. Sentrifuger cellene på nytt (400 x g, 5 min) og re-suspendere i kulturmediet ved passende tetthet (se trinn 4.1). 4. Samtidig ruge T-celler og DC Seed T-celler og DCS i en 2: 1 T: DC-forholdet i en 24-brønn eller 96-brønners cellekulturplate. Sørge for at den endelige kulturvolumet er ≤500 pl for 24-brønners plater eller ≤50 pl for 96-brønners plater. MERK: mindre volumer oppmuntre celle-celle interaksjoner og gi plass for etterfølgende fikseringsbuffer. Juster nøyaktige celle tall empirisk, men som en generell veiledning, bruker 1 x 10 6 T-celler og 0,5 x 10 6 DC per brønn (96-brønns plate). Disse skal betraktes som minimum antall celler, fordi ved hjelp av færre celler gjør telling av immun synapser vanskelige. For å øke celleantallet, sette opp replikate brønner og basseng etter trinn 5 (fiksering). MERK: Når du setter opp replikere brønner, er det tilrådelig å frø DC i alle brønnene først og deretter seedet T-celler i alle brønner; Dette minimaliserer uregelmessigheter i inkubasjonstid mellom brønnene. Platen inkuberes i 4 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. e_title "> 5. Fix Celler i Plate Tilsett 3 ganger kulturvolum på 1,5% formaldehyd i PBS til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 30 min; tt er viktig for å feste celler før de fjernes fra platen for å minimalisere avbrudd av celle-celle-interaksjoner. Overfør cellene i platen inn i rør for påfølgende vasking og farging. På dette stadiet, avsatt flere celler for enkeltflekk kontroller. Bortsett fra disse kontrollene, bør hele kulturen være farget med antistoffet cocktail (se trinn 4.1.1). 6. Stain Cells Beis cellene i 100 ul vaskebuffer inneholdende en blanding av de ønskede fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. MERK: cocktail inneholder T-celle-spesifikke og APC-spesifikke antistoffer. Fluorokromer bør velges slik at de kan skilles ved å bruke konfigurasjonen på bilde strømningscytometer. i than eksperimenter er vist her, blå fluorofor-konjugert CD11b (5 ug / ml, se tabell of Materials) og APC-konjugert CD90.2 (5 mikrogram / ml) ble anvendt. Vask cellene i 1 ml vaskebuffer og sentrifuger i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. * Resuspender cellene i perm-vaskebuffer inneholdende phalloidin FITC ved 0,05 til 0,5 mikrogram / ml og inkuberes i 30 min ved romtemperatur, beskyttet mot lys. MERK: Phalloidin FITC konsentrasjoner på ca. 0,1 ug / mL fungere godt for museceller, men den passende konsentrasjon er forventet å variere fra leverandør, celletype, og avbildning strømningscytometer. Vask cellene i 1 ml perm / vaskebuffer og sentrifuger i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. * Resuspender cellene i perm / vaskebuffer inneholdende kjernefysiske fargestoff ved passende konsentrasjon (f.eks, omtrent 25 mikrogram / ml 7-AAD) og inkuber i 30 min ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Vask cellens i 1 ml perm / vaskebuffer og sentrifuger i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. Vask cellene en gang i vaskebuffer, pellet, og resuspendere i 50 – 100 ul vaskebuffer, å overføre cellene til små, avkortet mikrosentrifugerør. Fortsett til datainnsamlings umiddelbart eller lagres i cellene ved 4 ° C beskyttet fra lys i opptil flere dager før anskaffelse på bilde strømningscytometer. MERK: Celler har blitt lagret på denne måten i inntil 7 dager. Lengre lagring kan være mulig, men er ikke testet. 7. Innhente data Initial og konfigurere bilde strømningscytometeret i henhold til produsentens instruksjoner. Sikre stabilitet av strømningen kjernen før samling av data. Reservere en kanal for lysfelt bildeopptak. Erverve enkeltflekkstyredata med den lysfelt kanal slått av. Klikk på "Last ned" knappen og insert et rør inneholdende et fullt farget prøve (en prøve som er blitt farget med alle nødvendige fluorokromer) i holderen. I "arbeidsområdet" vindu, velge og lage en ny scatterplot med sideforhold over hele området og portsingletter hvor sideforholdet er nær 1. Lag en ny spredningsplott for hver kanal som brukes (intensitet av kanalen i den horisontale akse) . For hvert fluorokrom, sjekk den positive befolkningen og, om nødvendig, justere laseren spenningen i "Illumination" boksen. Lossing av rør og legg den første enkelt-farget rør. I "Anskaffelses Settings" skriver utvalget navn og angi antall hendelser som skal samles inn, hvis det er en enkelt flekk (for kompensasjon kontroller), 1000 – 2000 hendelser er tilstrekkelig. I "kanaler" -boksen, velge kanaler som hver prøve er blitt farget med. For enkeltflekk kontroller, bør alle kanaler velges med brightfield og sidespredning av. Klikk på "Record" -knappen under "Kjøp" boksen; når antall hendelser når den angitte grensen, vil oppkjøpet stoppe automatisk. Klikk på "Return" tasten for å lesse av røret. Gjenta trinn 7.2.4 – 7.2.6 for hver enkelt flekk kontroll. Avhengig av cytometer og programvare, kan det ikke være mulig å sette alle de som er vist i figur 1 under innsamling porter (mer presist port blir utført i løpet av analysen, se kapittel 8). Ta vannprøver som for enkeltfarget prøver (i trinn 7.2), men i "kanaler" boksen velger alle kanaler som er nødvendige, herunder lysfelt kanal. Før opptak av data, kontrollere for å bekrefte at kanalen intensitet er hensiktsmessig for å identifisere de ønskede cellepopulasjoner. Hvis ikke, justere laser innstillinger og re-registrering enkeltflekk styrer ved hjelp av de nye innstillinger, slik som beskrevet i trinn 7.2. For hverprøve, erverve flere titusener av hendelser. MERK: Under de fleste forhold, celle-celle kontakt hendelser er et lite mindretall av det totale celle nummer (de fleste er enkeltceller). I alminnelighet er det ønskelig å ha minst 100 hendelser i den endelige membranen kontakt gate. 8. analysere dataene Analysere data innhentet på bilde flowcytometeret bruke analytisk programvare tilgjengelig gratis fra produsentens hjemmeside (en brukerkonto må opprettes, se Table of Materials). Figur 1. gating Strategy brukes til å identifisere Alloreaktive immun Synapser. A. In-fokushendelser blir portstyrt fra alle hendelser ved å gå gjennom celle bilder basert på rot-middel-kvadratet av hastigheten for forandring av den bildeintensitetsprofilen (Gradient RMS) ved hjelp av lysfelt channel (kanal 4, Ch04), som beskrevet i teksten. B. Blant i-fokus hendelser, blir dubletter skiller seg fra enkle celler ved plotting av sideforholdet som funksjon av området for lysfelt-kanalen. Enkeltceller er gruppert nær den sideforhold på 1 og har et mindre område, mens dubletten er nær 0,5 og ha et større område. C. Fluorescensintesiteten av APC (i dette tilfellet, en dendrittcelle [DC] markør, CD11c) blir deretter plottet mot fluorescensintensitet av T-celle-markør (i dette tilfellet, CD90.2), og dobbel-positive hendelser portstyres. Grensene av gate kan være raffinert ved å gjennomgå bilder av hendelser i nærheten av landegrensene. D. T-APC dubletter blir deretter raffinert slik at de inneholder bare en APC ved å plotte sideforhold i forhold til arealet av APC markør (CD11c, Ch02). E. Disse enkelt APC dubletter blir deretter raffinert slik at de inneholder bare én T-celle ved å plotte sideforholdet kontra områdetav T-celle-markør (CD90.2, Ch06). F. Endelig hendelser som inneholder bare to kjerner velges ved å avsette et histogram av den flekk tellingen på kjernefarge kanal (7-AAD, Ch05) og en port hendelser som inneholder bare 2 7-AAD-positive flekker (dvs. kjerner). Hendelsene i denne port blir analysert for membran kontakt og synapse formasjonen, som beskrevet i figur 2. Dataene ble analysert på en blindet måte i forhold til behandlingsoppgave og er fra et tidligere eksperiment utgitt 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. MERK: Port-stillings strategi er beskrevet i dette avsnitt, og er vist i figur 1. Analyse av avbildnings flowcytometri data skal utføres på en blindet måte i forhold til behandlingsoppgave. Selv om vi mener at immun synapser og ikke-synaptic kontakter er vanligvis lett preges (se nedenfor og figur 2 og 3), blinding redusere skjevhet som oppstår fra en subjektiv iboende til bildeanalyse. Generere en kompensasjon matrise ved lasting av enkeltflekk kontroll datafiler til kompensasjon veiviseren. Etter lasting for en-farget filer, velger de fluorescerende kanaler benyttet i forsøket. MERK: Programvaren genererer automatisk en kompensasjon matrise, men dette bør være manuelt validert for å sikre at de riktige positive populasjoner ble valgt. Dobbeltklikk på en verdi i matrisen og tilsett grafen til analyseområdet. Lag en ny port om nødvendig for å ekskludere noen døde celler / dubletter / falske positiver; denne nye raffinerte positive befolkningen kan velges i matrisen boksen i rullegardinmenyen for hver kanal. Gjenta dette for hver kanal. Klikk på "Finish" for å lagre kompensasjn matrise (.ctm fil). Oppnå en dataanalyse fil (.daf) fra den rå fil (.rif) ved å laste inn .rif filen inn i analyse-programvare og påføring av kompensasjonsmassen. Etter at data er lastet, utfører port for å identifisere T-celle-APC kontaktarrangementer. MERK: En typisk lede strategien innebærer å identifisere i-fokus hendelser, velge dubletter basert på størrelse kriterier (i feltet i forhold til sideforholdet til hendelse), og valg av T-celle-APC dubletter som hendelser som er dobbel-positive for den T-celle og APC markører (Figur 1A-C). MERK: Sideforholdet er forholdet mellom bredden av en hendelse til sin høyde, som tillater diskriminering av enkeltceller (forhold nær 1) fra dubletter (forhold nær 0,5). Identifisere i-fokus hendelser ved å plotte rot-middel-kvadratet av hastigheten for forandring av avbildningsintensitetsprofil (gradient RMS) i lysfelt kanal (figur 1A). Klikk på the gradient RMS histogram for å vise celle hendelser i individuelle beholdere, og deretter plassere en port unntatt ut-av-fokus arrangementer. Plott område sammenliknet med sideforholdet til lysfelt kanal og tegne en port som identifiserer dubletter basert på arrangementet form og størrelse (figur 1B). Gjennomgang av bilder av hendelser bare i og utenfor grensen til denne porten kan hjelpe analytikeren å avgrense porten størrelse og plassering. Deretter konstruere en grafisk fremstilling av disse doublet hendelser der intensiteten av T-celle-markør vises på en akse og intensiteten av APC-markør vises på den andre. Tegn en T-APC dublett port inneholdende hendelser som er positive for begge markører. Blant T-celle-APC doublet arrangementer, ved å velge hendelser som inneholder bare én T-celle og en APC. Dette gjøres ved å plotte sideforholdet som funksjon av området for APC markør og ved signalutvelgelse på dubletter inneholder en enkel APC (figur 1D). Plott sideforholdet som funksjon av området for den T-celle-merketer og gate på dubletter inneholdende en enkelt T-celler (figur 1E). MERK: Ytterligere forbedring kan oppnås ved å plotte et histogram av den flekk tellefunksjonen som påføres kjernefarge fluorescens og separasjon på hendelser med bare to flekker (figur 1F). I noen tilfeller vil de to celler i en dublett ikke være i kontakt; for å identifisere celler i kontakt med hverandre, definerer objekt masker for APC-er og T-celler. Bruk "Masker" i Analyse-menyen for å åpne masker leder og definere en ny maske. Skriv inn et navn, for eksempel "T-celle objekt maske." Klikk på "Function" -knappen, og i dialogboksen, velg "Object". Velge den kanal i hvilken den T-celle-markør blir detektert (f.eks Ch06). Klikk på "OK". NB: "Object (M06, Ch06, Tight)" vises i funksjonsboksen. Denne standard objekt maske vanligvis works godt men kan kreve optimalisering. Gjenta denne prosess for å skape en APC objekt maske i den aktuelle kanal. Etter identifisering av APC og t-celle masker, bestemme membran kontakt ved plotting av T-celle-markør fluorescensstyrke i APC-objektet masken mot APC fluorescensstyrke i det T-celle-objekt maske. På dette diagram trekke en port som bare omfatter celler i kontakt med hverandre. MERK: Vanligvis er det ganske klart dobbelt-positive og dobbelt-negative populasjoner (figur 2A). Grensen mellom de doble-positive og dobbelt-negative populasjoner kan innstilles ved å gjennomgå lysfelt bilder av celler i grenseområdet for å sikre at celler i kontakt er innenfor porten, og at celler som ikke er i kontakt er utelukket. På dette stadiet, manuelt gjennom falloidin FITC bilder av hendelser innenfor denne port for å skille modne immun synapser fra en enkel celle-celle-kontakt. USE den "tag bilder" funksjon for å markere disse bildene. MERK: Prosentandelen av merkede hendelser (immun synapser) inne i denne port kan bli brukt som en indeks for direkte alloreaktiviteten i T-cellepopulasjon som studeres.

Representative Results

Denne metoden ble anvendt for å undersøke CD4 + T-celle alloreaktiviteten i mus utførte tolerante overfor donor alloantigener før heterotopisk cardiac allograft transplantasjon. CBA-mus (H-2k) ble gitt en tolererprotokoll bestående av en donor-spesifikk (B6, H-2 b) blodoverføring i kombinasjon med et ikke-utarmende CD4-antistoff en måned forut for å motta et B6 hjertetransplantasjon. Denne protokollen gir langvarig allograft-overlevelse som er avhengig av foxp3 + regulatoriske T-celler 36, 37. Syv dager etter transplantasjonen, ble milt-CD4 + T-celler oppnådd fra tolerante og ikke-tolerante mottakere av B6 hjerte allotransplantater og ble ko-inkubert med B6 benmargavledede DC i henhold til denne protokollen. Figur 2 viser representative data fra dette eksperimentet. Membranen kontakt port er vist i figur 2A, med grønne trådkorset plassert på en synaptic hendelse (venstre panel, 1) og på en ikke-synaptisk aktivitet (høyre panel). Figur 2B viser lysfelt og fluorescens kanaler for dette arrangementet. For å redusere skjevhet ble data analysert ved hjelp av en observatør blindet for behandling oppgave 23. Som vist i flere eksempler i figur 3, både fra ikke-tolerante (Figur 3A-B) og toleriserte (figur 3C-D) CBA-mottakere av B6 hjerter, synapser er lett skilles fra ikke-synaptiske kontakter etter tilstedeværelsen av en tett FITC-positiv rygg ved T-APC grensesnitt. Disse resultatene viser at visuell påvisning av immun synapser laget av mottaker-T-spor med graden av alloreaktiviteten i mottakeren. Figur 2. Identifisering av T-APC Dubletter med MembraneKontakt og Immune Synapse formasjonen. Hendelser i den endelige dublett porten (figur 1 F) blir analysert. A. T-cellemarkør fluorescens i APC gjenstanden masken er plottet mot APC markør fluorescens i DC-objekt masken. Noen doublet hendelsene har en APC og en T-celle uten celle-celle-kontakt og vist i nederste venstre hjørne av tomten (bilder ikke vist). En membran kontakt port kan således trekkes at bare inneholder dubletter, hvori T-celler og APC er i kontakt. Bilder av hver hendelse i denne port blir vurdert for bevis av aktin cytoskeletal omleiring i phalloidin-FITC kanal og kan merkes ved hjelp av dataanalyser. Det venstre panelet angir en immun synapse hendelse (merket 1 og angitt med grønne trådkors), mens det høyre panelet angir en membran kontakt hendelse uten immun synapse-dannelse (som er merket 2 og angitt med grønne trådkors). Fastsetting av synapse formasjon krever manuell gjennomgang av dissebilder, som er vist i B. B. Den øverste raden viser lysfelt og fluorescens kanalsbilder for en dublett med en immun synapse (tilsvarende hendelse 1 i A); den nederste rekken viser en dublett med membran kontakt, men mangler synapse formasjon (tilsvarende hendelse 2 i A). Dataene ble analysert på en blindet måte i forhold til behandlingsoppgave og er fra et tidligere eksperiment utgitt 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3. Eksempler på T-APC Synapse dannelse. CBA-mus mottok kardiale allotransplantater fra B6-donorer etter enten ingen forbehandling (AB) eller etter toleranseinduksjon med B6 helblod under dekke av et ikke-utarmende anti-CD4-antistoff ( <st Rong> CD). Etter 7 dager ble milt-CD4 + T-celler testet for dannelse synapse med B6 DC. A. Tre eksempler på ikke-synaptiske dubletter med membranen kontakt fra en ikke-tolerante dyr. B. Tre eksempler på immun synapser fra et ikke-tolerante dyr. C. Tre eksempler på ikke-synaptiske dubletter med membranen kontakt fra en tolerante dyr. D. Tre eksempler på immun synapser fra en tolerante dyr. Synapse dannelse er indikert ved nærværet av en lys, FITC-positiv rygg ved T-APC-grensesnitt (CH03). Dataene ble analysert på en blindet måte i forhold til behandlingsoppgave og er fra et tidligere eksperiment utgitt 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. ays "> Antistoff / Dye fluorochrome Kanal Konsentrasjon CD11c eF450 Ch02 5 ug / ml, titrere empirisk CD90.2 APC Ch06 5 ug / ml, titrere empirisk phalloidin FITC CH03 0,05 til 0,5 ug / mL 7-AAD – Ch05 25 pg / mL Tabell 1. Antistoffer og fargestoffer som brukes i denne studien. Fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer, fargestoffer, leverandører, og anbefalte konsentrasjoner er vist i tabellen. Avbildnings strømningscytometer kanal som ble benyttet for å detektere hvert fluorokrom er også vist i tabellen.

Discussion

Imaging flowcytometri har blitt brukt for å demonstrere immun synapse dannelse mellom monoklonale T-celler og APC, eller i nærvær av superantigener 24, 25, 26, 27, 28. Denne metoden tar fordel av det faktum at etter en produktiv T-celle-APC kontakt, omleires T-celle dens aktin cytoskjelettet og polarisert den mot kontaktstedet 21. Denne omleiring skjer ikke uten TCR-signalisering, og det er derfor et tidlig korrelat av T-celleaktivering 19, 20, 21. Metoden som presenteres her tilpasser seg denne tilnærming til måling av alloreaktive T-cellehyppighet i polyklonale T-cellepopulasjoner. Som sådan kan det i fremtiden tjene som grunnlag for utvikling av metoder for donor reactivi ty i klinisk transplantasjon.

Selv om direkte sammenligninger har ennå ikke blitt gjort, påvisning av alloreaktive immun synapser ser ut til å ha overlegen prediktiv kraft enn den konvensjonelle MLR. For eksempel har tidligere arbeid vist at i den tolerer protokollen beskrevet ovenfor, resultatene av en MLR mislykkes i å på en pålitelig måte korrelere med pode utfall 2.

En rekke forsøk har blitt utviklet for operativt tolerante tilstand hos mennesker 9, 10, 11, selv om disse ikke måle effektor-celle funksjon som respons på alloantigen. I motsetning til dette, assayer IFNy ELISPOT 8 mål effektor-T-celle-funksjon, men kan ikke fange opp hele spekteret av cytokinsekresjon som kan være relevant for akutt og kronisk allograft avvisning, slik som IL-17 38,> 39. Den begrensende fortynningsanalyse 4, noe som er arbeidskrevende, og det trans-vivo-analyse 6, noe som krever mus, har betydelige praktiske begrensninger som ville hindre deres anvendelse i en klinisk sammenheng. Nylige forbedringer på analyse av prolifererende celler ved hjelp av TCR-sekvensanalyser av T-celler som responderte på MLR kan være av verdi, men som analysen er presentert her, vil kreve ytterligere validering i kliniske studier 18, 40.

Videreutvikling av immun synapse påvisningsassayet vil kreve at en rekke viktige spørsmål skal besvares. Først analysen som utviklet måler bare direkte alloreaktiviteten. Den direkte vei involverer presentasjonen av allogene MHC / peptid-komplekser på donor-avledede APC. Sistnevnte er generelt elimineres raskt etter transplantasjon, og ytterligere alloantigen presentasjon er Carried ut av mottaker APCer som presenterer intakt donor MHC (halv direkte vei) eller bearbeidede donorantigener på eget MHC (indirekte vei). Den indirekte bane er en viktig drivkraft for kronisk allograft avvisning 33, 41.

I prinsippet skulle det være mulig å detektere indirekte immun synapser anvendelse av denne analyse, men indirekte alloreaktive T-celler har en mye lavere frekvens enn direkte som 42, 43, noe som betyr at analysen av et større antall arrangementer vil være nødvendig. Et annet hensyn er at vi har bare testet dette forsøk ved anvendelse av CD4 + -T-celler, mens CD8 + T-celler er også en viktig komponent i den anti-donor respons. Igjen bør det være mulig å detektere CD8 + T-celle-APC synapser ved hjelp av denne metoden. En annen begrensning er at metoden krever manuell vurdering og analyse av celle bildene i den endelige medlrane kontakt gate, og vi jobber for tiden med automatisering av dette trinnet.

Til slutt krever fremgangsmåten testing og utvikling hos mennesker, og preliminære studier med humane prøver er for tiden utføres. Videre fenotypisk T-celleundergruppen analyse (dvs. effektor, hukommelse, regulatoriske, etc.) i kombinasjon med detektering av immun synapser i transplanterte som ville representere en kraftig metode for å karakterisere alloreaktive T-cellerepertoaret og vil være et viktig fokus fremtidig arbeid.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SCJ ble støttet av en internasjonal forening for hjerte- og lungetransplantasjon Stipendiat og Royal College of Physicians og kirurger i Canada Detweiler Reising Fellowship.SM ble støttet delvis av en International Society for hjerte- og lungetransplantasjon Career Development Award (til SCJ). SS ble støttet av National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH er mottaker av en nyre Research UK Senior prekliniske Fellowship. Dette arbeidet ble finansiert av følgende tilskudd til AB og KW: en Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), en British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504), og EUs rammeprogram 7 (én studie, BioDRIM). Forfatterne ønsker å takke Michael Parsons og flowcytometri Kjerne Facility på Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto for å gi tilgang til og støtte med ImageStream Mark X instrument.

Materials

Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Tags

T Cell AlloreactivityImaging Flow CytometryTransplant ImmunologyDendritic CellsT CellsCell-cell InteractionsFluorescent MicroscopyFlow CytometryCell CultureFixationStainingPerm/wash BufferNuclear DyeBrightfield Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image