JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Immunologie und Infektion

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

Published: April 19, 2017
doi:
10.3791/55283
, , , , ,
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute,University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute,University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology,University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital,University of Oxford

Summary

Dette papir beskriver en fremgangsmåde til måling alloreaktivitet i en blandet population af T-celler under anvendelse af billeddannelse flowcytometri.

Abstract

Målingen af ​​immunologisk reaktivitet til donorantigener i transplantatmodtagere sandsynligvis er afgørende for en vellykket reduktion eller tilbagetrækning af immunosuppression. Den blandede leukocyt-reaktion (MLR), med begrænsende fortynding assays og trans-vivo forsinket hypersensitivitet (DTH) assay er alle blevet anvendt på dette spørgsmål, men disse fremgangsmåder har begrænset prædiktiv evne og / eller betydelige praktiske begrænsninger, som mindsker deres anvendelighed. Billeddannelse flowcytometri er en teknik, der kombinerer de multiparametric kvantitative beføjelser flowcytometri med de billeddannende evner fluorescensmikroskopi. Vi har for nylig gjort brug af et billeddannende flowcytometri tilgang til at definere andelen af ​​recipient-T-celler i stand til at danne modne immune synapser med donor antigenpræsenterende celler (APC'er). Under anvendelse af en velkarakteriseret muse hjertetransplantatmodel har vi vist, at hyppigheden af in vitro immune synapser blandt T-APC Membrane kontakt begivenheder stærkt forudsagt allotransplantat resultat i afvisning, tolerance og en situation, hvor transplantation overlevelse afhænger af inducerede regulatoriske T-celler. Frekvensen af ​​T-APC kontakter forøget med T-celler fra mus under akut afstødning og faldt med T-celler fra mus afsmeltet reagerer på alloantigen. Tilsætningen af regulatoriske T-celler til in vitro-systemet reducerede forlængede T-APC kontakter. Kritisk, blev denne effekt også ses med humant polyklonalt ekspanderet, naturligt forekommende regulatoriske T-celler, som er kendt for at kontrollere afvisning af humane væv i humaniserede musemodeller. Videreudvikling af denne fremgangsmåde kan give mulighed for en dybere karakterisering af alloreaktive T-celle rum i transplanterede patienter. I fremtiden, kan yderligere udvikling og evaluering af denne fremgangsmåde under anvendelse af humane celler danne grundlag for assays, der anvendes til at udvælge patienter for immunosuppression minimering, og det kan anvendes til at måle virkningen af ​​tolerogenic behandlinger i klinikken.

Introduction

Organtransplantation har forvandlet pleje af patienter med terminal fase sygdomme i nyre, lever, hjerte og lunger. Grund af forskelligheden i større og mindre histokompatibilitetsantigener imidlertid allotransplantater omgående afvist af recipient-T-celler, hvis der ikke anvendes immunsuppressive lægemidler. Disse agenter har mange bivirkninger, herunder risici for kræft og organsvigt. Et stort klinisk mål er derfor at sænke dosis af immunosuppression til det minimum, der kræves for at forhindre afstødning. Dette niveau kan variere afhængig af graden af ​​aktivering af det medfødte immunsystem; graden af ​​donor-recipient alloantigen mismatch; og inter-patient forskelle i immunforsvaret, farmakokinetik og farmakodynamik.

Desværre har transplanterede klinikere ikke nogen værktøjer til præcist at vurdere donor reaktivitet i individuelle patienter 1. den blandedeleukocyt-reaktion (MLR) kan detektere donor reaktivitet, men den ikke pålidelige skøn graft udfaldet 2, 3. Begrænsende fortynding assays, cytokine ELISPOTs og trans-vivo-assay enten måle en begrænset række svar eller ikke er praktisk 4, 5, 6, 7, 8 .Gene ekspressionsprofiler har afsløret signaturer relateret til operationel tolerance 9, 10, 11, 12 og afvisning 13, 14, 15, men disse er ikke altid generaliseres tværs populationer 16 og kan i sidste ende har begrænset anvendelighed i individuelle patienter. Sekvens-baserede anases af T-cellereceptoren (TCR) af T-celler i det perifere blod 17 eller prolifererende i MLR 18 er også blevet udviklet, men kræver yderligere validering.

Begrebsmæssigt ville det være ønskeligt at have et assay, der påviser de tidligste nødvendige foranstaltninger i modtagerens T-celleaktivering ved en donor antigen. Eftersom dyrkning af celler over dage (som i MLR) kan introducere artefakter, ville en sådan test ideelt set ikke kræver måling af nedstrøms begivenheder, såsom proliferation eller effektorfunktion. Lige, men det ville også være ønskeligt, at testen afhænge et element af T-cellefunktion, da rent beskrivende vurderinger (Fx TCR-sekventering) kan være ude af stand til at skelne mellem anerge og funktionelle T-celler.

Talrige studier har indikeret, at langvarig T-APC kontakt er nødvendig for dannelsen af ​​en immun synapse, hvilket er et væsentligt førstetræde i T-celle-respons 19, 20, 21, 22. Vi rapporteret for nylig, at, under dynamisk in vitro tid bortfalder billeddannelse, ca. 5 – 10% af muse CD4 + T celler danner langvarige kontakter med allogen knoglemarvsafledte dendritiske celler (BMDCs) 23. Hyppigheden af længerevarende kontakt blev forøget i dyr, der forkastede en graft, hvor det tidligere i mus gjort tolerante til de samme antigener, forblev på et niveau set i utransplanteret mus 23. Langvarig interaktioner blev reduceret i nærvær af modtageren tregs og forøget i deres fravær, og vi observeret lignende fænomener anvendelse af humane T-celler og allogene monocytafledte DC'er (MoDCs) 23.

Imidlertid tælling af forlængede kontakter foretages inden for en polyklonal T-celle population er tidskrævende og arbejdskrævende. Vi gjorde derfor brug af billedbehandling flowcytometri til at undersøge allogen immun synapse dannelse. Billeddannelse flowcytometri inkorporerer multiparametric indsamling og analyse af data kapaciteter af konventionel flowcytometri med de encellede billeddannende evner fluorescensmikroskopi. Denne teknik er blevet anvendt af andre forskere til at studere immun synapsedannelse af monoklonale T-celler 24, 26, 27 eller i nærvær af superantigener 28. I sådanne indstillinger imidlertid frekvensen af responderende T-celler varierer 30-100%, mens alloreaktive T-celler generelt skønnes at udgøre 5-15% af den totale T-celle-repertoire 29, 30, 31, 32. Vigtigst viste vi, at billeddannelse flowcytometri kan producere avery sammenligneligt mål for alloreaktive T-celle frekvens 23 og at ændringer i synapsen frekvens inden for en polyklonal T-celle population er prædikative for graft resultat 23. Øjeblikket, har denne fremgangsmåde blevet optimeret til at måle direkte alloreaktivitet af CD4 + T-celler, men i princippet kan det også blive udviklet til at undersøge CD8 + T-celler og den indirekte vej. Indirekte alloreaktivitet menes at blive mere og mere relevant på længere tider efter transplantation 33. Vi er ved at udvikle denne metode til at bruge humane celler, hvilket vil give mulighed for at teste i patienter. Således i fremtiden, kan den samlede fremgangsmåde være anvendelig til den funktionelle evaluering af T-celle responser i transplantatmodtagere før transplantation; umiddelbart efter transplantation; og på længere sigt, når narkotika minimering bliver et vigtigt mål.

Protocol

1. Forbered Reagenser og materialer Forberede phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) ( "vaskebuffer"). Forbered PBS med 2% FCS indeholdende 0,1% ikke-ionisk detergent ( "perm-vaskebuffer", se tabellen of Materials). Forbered PBS med 1,5% formaldehyd. BEMÆRK: ADVARSEL! Formaldehyd er ætsende og potentielt kræftfremkaldende og skal håndteres, mens iført egnede personlige værnemidler. Forberede PBS indeholdende 2% FBS og 0,5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til magnetisk celleseparation ( "MCS-buffer"). Forbered 50 pg / ml phalloidin-fluoresceinisothiocyanat (Phalloidin-FITC) i dimethylsulfoxid (DMSO). Fremstilling af en 1 mg / ml nuklear farvning (f.eks 1 mg / ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD) i DMSO eller bis-benzimid farvestof, se tabel of Materials) i DMSO. Forberede fluorochrom-mærkede antistoffer passende for cellerne af interesse ogdet billeddannende flowcytometer. Opnå dyrevæv (fx lymfeknuder og milt) som en kilde for T-celler og allogene dyrevæv (fx milt og knoglemarv) som en kilde til antigen-præsenterende celler eller stamceller. Forberede celledyrkningsmedium (fx Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% FBS), 50 uM 2-mercaptoethanol, penicillin og streptomycin og opnå 24- og / eller 96- godt cellekulturplader. 2. Forbered antigenpræsenterende celler BEMÆRK: I teorien kunne enhver APC befolkning undersøges med denne metode. Umodne muse knoglemarvsafledte dendritiske celler (DC'er) som APC'er blev sagsøgt i dette tilfælde. Mange protokoller findes for generering disse celler (f.eks Referencer 34 og 35). Kort fortalt blev den følgende protokol anvendt. Flush marv fra lårben og skinneben i RPMI 1640 eller DMEM. Passere suspenderede celler gennem en 70-um cellefilter at fjerne små stykker af ben og snavs. Pelletere cellerne ved centrifugering og herefter lysere røde blodlegemer under anvendelse af en ammoniumchloridbuffer i 5 minutter ved stuetemperatur. Pelletere cellerne ved centrifugering (400 xg, 5 minutter) og resuspender cellepelleten. Vask cellerne i 5 – 10 ml vaskebuffer, pellet ved centrifugering (400 xg, 5 min), og re-suspendere cellepelleten. Berige hæmatopoietiske precursorer over en celle separation kolonne ved at mærke cellerne med biotinyleret anti-CD3 (5 ug / ml), anti-B220 (5 ug / ml), anti-MHC klasse II (1 pg / ml) og anti-CD11b (5 ug / ml) antistoffer. Pelletere cellerne ved centrifugering (400 xg, 5 minutter) og genopslæmmes cellepelletten. Inkubér cellerne med anti-biotin magnetiske mikroperler (se tabel of Materials) ved 4 ° C i 10 min. Vaske og pelletere cellerne (400 xg, 5 minutter) og re-suspend dem i 1 ml MCS buffer inden fjernelse af de mærkede celler under anvendelse af et stort positiv selektion (LS) magnetisk celleseparation kolonne primet med 3 ml MCS puffer og anbragt i sin magnet. Vask søjlen 3 gange med 3 ml af MCS-buffer; gennemløbet vil indeholde de ønskede celler. Dyrke cellerne, der passerer gennem søjlen i 6 dage i RPMI 1640 eller DMEM suppleret med 2 ng / ml rekombinant muse granulocytmakrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og 2 ng / ml rekombinant human transformerende vækstfaktor β1 (TGF-Ø1) . Erstatte halvdelen af ​​mediet hver 2 dage med frisk komplet medium indeholdende 2 ng / ml GM-CSF og TGF-Ø1. BEMÆRK: Humant TGF-Ø1 har aktivitet i museceller. Data er genereret ved hjælp af disse umodne DC'er. Andre celler (fx B-celler og modne DC'er) kan være egnet som APC'er, men er ikke blevet testet i dette assay. Cryopreservering DC'er i 90% serum / 10% DMSO og opbevares i flydende nitrogen; inddrive pådagen for brug. Før brug, tælle antallet af levedygtige DC'er i et hæmocytometer hjælp trypanblå eksklusion. Resuspender cellepelleten i dyrkningsmedium med passende tæthed (se trin 4.1) før anvendelse i afsnit 4. 3. Forbered T-celler Brug negative udvælgelsesmetoder at undgå utilsigtet transmission aktiverende eller inhibitoriske signaler til cellerne. BEMÆRK: I dette eksempel er CD4 + -T-celler fremstilles til analyse. Til fremstilling CD4 + -T-celler fra muse milt, mash milten gennem en 70-um cellefilter anvendelse stempel en sprøjte. Vask cellefilter med vaskebuffer. Pelletere suspenderede celler ved centrifugering (400 xg, 5 min) og derefter lysere de røde celler ved at resuspendere pelleten i en ammoniumchloridbuffer i 5 minutter ved stuetemperatur. Pelletere cellerne ved centrifugering (400 xg, 5 minutter) og genopslæmmes pelleten. Vask cellensi 5 – 10 ml vaskebuffer og pellet efter centrifugering (400 xg, 5 min). Re-suspendere pillen. Farv cellerne med biotinylerede antistoffer mod CD8, større histokompatibilitetskompleks klasse II (MHC II, 1 pg / ml) og CD19 (5 pg / ml). Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C. Vask cellerne i 10 ml vaskebuffer og pellet ved centrifugering (400 xg, 5 min). Re-suspendere pillen. Inkubér cellerne med anti-biotin magnetiske mikroperler (se tabel of Materials) ifølge producentens anvisninger. Vask cellerne i 10 ml vaskebuffer og pellet ved centrifugering (400 xg, 5 minutter); re-suspendere pellet. Resuspender cellerne i 1 ml MCS puffer og berige CD4 + -T-celler over en magnetisk celle separation kolonne primet med 3 ml MCS puffer på en magnet. Vask søjlen 3 gange med 3 ml af MCS puffer. Kolonne gennemstrømning vil indeholde de berigede T-celler. Ved standard flow cytomeprøve, vurdere T-celle renhed under anvendelse af en portion af de negativt selekterede celler. Farv cellerne under anvendelse af et fluorochrom-streptavidinkonjugat (at identificere eventuelle biotinmærkede celler, der skulle have været fjernet på søjlen) og et antistof eller antistoffer til at identificere T-cellepopulationen af ​​interesse (CD4 i dette tilfælde); en renhed på ≥85% er acceptabel 23. Tæl T-celler i et hæmocytometer ved trypanblåt-udelukkelse (≥90% levedygtighed er acceptabel). BEMÆRK: MCS buffer indeholder EDTA, som skal fjernes før assayet. For at opnå dette, pelletere cellerne ved centrifugering (400 xg, 5 min) og vaskes i 1 ml vaskebuffer. Pelletere cellerne igen (400 xg, 5 minutter) og resuspendere i dyrkningsmedium med passende tæthed (se trin 4.1). 4. Co-inkubere T-celler og DC'er Seed T-celler og DC'er på en 2: 1 T: DC-forhold i en 24-brønds eller 96-brønds celledyrkningsplade. Sikre at det endelige dyrkningsvolumen er ≤500 pi i 24-brønds plader eller ≤50 pi i 96-brønds plader. BEMÆRK: Mindre mængder fremme celle-celle-interaktioner og give plads til efterfølgende fiksering buffer. Justere præcise celleantal empirisk, men som en generel vejledning, bruger 1 x 10 6 T-celler og 0,5 x 10 6 DC'er per brønd (plade med 96 brønde). Disse bør betragtes som de mindste antal celler, fordi brug af færre celler gør opregning af immun synapser vanskelige. At øge celletal, nedsat replikatbrønde og pool efter trin 5 (fiksering). BEMÆRK: Når opsætning replikatbrønde, er det tilrådeligt at pode DC'er i alle brøndene først og derefter frø T-celler i alle brønde; dette minimerer afvigelser i inkubationstid mellem brønde. Inkubér pladen i 4 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. e_title "> 5. Fix Celler i Plate Tilsæt 3 gange dyrkningsvolumen på 1,5% formaldehyd i PBS til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter; tt er vigtigt at fastsætte celler før fjerne dem fra pladen at minimere den forstyrrelse af celle-celle-interaktioner. Overfør celler i pladen i rør til efterfølgende vask og farvning. På dette stadium, der er afsat yderligere celler til enkelt-pletten kontroller. Bortset fra disse kontrol bør hele kulturen farves med antistoffet cocktail (se trin 4.1.1). 6. Farv Celler Farv celler i 100 pi vaskebuffer indeholdende en cocktail af de ønskede fluorokromkonjugerede antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. BEMÆRK: Cocktail omfatter T-celle-specifik og APC-specifikke antistoffer. Fluorochromer bør vælges således, at de kan skelnes ved hjælp af konfigurationen af ​​den billeddannende flowcytometer. i than eksperimenterne vist her, blå fluorofor-konjugeret CD11 (5 pg / ml, se tabel of Materials) og APC-konjugeret CD90.2 (5 ug / ml) blev anvendt. Vask cellerne i 1 ml vaskebuffer og centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. Resuspender cellerne i perm-vaskebuffer indeholdende phalloidin FITC på 0,05-0,5 ug / ml og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. BEMÆRK: Phalloidin FITC koncentrationer på ca. 0,1 ug / ml fungerer godt for museceller, men forventes den passende koncentration, der varierer med leverandøren, celletype, og billeddannelse flowcytometer. Vask cellerne i 1 ml Perm / vaskebuffer og centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. Resuspender cellerne i perm / vaskebuffer indeholder nukleart farvestof ved den passende koncentration (fx ca. 25 pg / ml 7-AAD) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Vask cellens i 1 ml Perm / vaskebuffer og centrifugeres i 5 minutter ved 400 x g. Dekanter supernatanten. Vask cellerne en gang i vaskebuffer, pellet, og resuspendere i 50 – 100 pi vaskebuffer, overføre cellerne til små, udjævnede mikrocentrifugerør. Fortsæt til dataopsamling straks eller opbevares cellerne ved 4 ° C beskyttet mod lys i op til flere dage før overtagelse på billeddannelse flowcytometer. BEMÆRK: Celler med succes er blevet gemt på denne måde i op til 7 dage. Længere opbevaring kan være muligt, men er ikke blevet testet. 7. Acquire data Initialiser og konfigurere den billeddannende flowcytometeret i overensstemmelse med producentens anvisninger. Sikre stabilitet af strømningen kerne forud for indsamlingen af ​​data. Reservere en kanal til erhvervelse lysfelt-billede. Anskaf kontroldata enkelt-plet med lysfelt kanal slukket. Klik på "Load" -knappen og Insert et rør indeholdende et fuldt farvede prøve (en prøve, der er blevet farvet med alle krævede fluorochromer) i holderen. I "arbejdsområdet" vindue vælges og skabe en ny scatterplot med formatforholdet over området og gate singletter hvor aspektforholdet er tæt på 1. Opret en ny scatterplot for hver anvendte kanal (intensitet af kanalen i den vandrette akse) . For hver fluorokrom, tjek den positive befolkning og om nødvendigt justere laseren spænding i feltet "Illumination". Losse røret og lægge den første single-farvede rør. I boksen "Acquisition indstillinger" skal du skrive navnet prøven og angive antallet af hændelser, der skal indsamles; hvis det er en enkelt plet (til erstatning kontroller), 1000 – 2000 begivenheder er tilstrækkelige. I feltet "Channels", vælge de kanaler, der hver prøve er blevet farvet med. For enkelt-pletten kontrol bør alle kanaler vælges med brightfield og sidespredning off. Klik på "Record" knappen under feltet "Acquisition"; når antallet af hændelser når den angivne tærskel, vil overtagelsen stopper automatisk. Klik på knappen "Tilbage" for at losse røret. Gentag trin 7.2.4 – 7.2.6 for hver enkelt plet kontrol. Afhængigt cytometeret og software, kan det ikke være muligt at indstille alle portene vist i figur 1 under erhvervelsen (mere præcis gating udføres ved analysen se afsnit 8). Erhverve prøver som for enkelt-farvede prøver (i trin 7.2), men i feltet "Channels", vælge alle kanaler, der kræves, herunder lysfelt kanal. Før registrering af data, check for at bekræfte, at kanalen intensitet er velegnet til at identificere de ønskede cellepopulationer. Hvis ikke, skal du justere laser indstillinger og re-rekord single-pletten kontrol ved hjælp af de nye indstillinger, som beskrevet i trin 7.2. For hverprøve, erhverve flere titusinder af begivenheder. BEMÆRK: Under de fleste betingelser, kontakt celle-celle arrangementer er et lille mindretal af det samlede celleantal (de fleste er enkeltceller). I almindelighed er det ønskeligt at have mindst 100 arrangementer i den endelige membrankontaktstedet gate. 8. Analyse af data Analyser data indhentet på den billeddannende flowcytometer bruge analytisk software til rådighed gratis fra producentens hjemmeside (skal være oprettet en brugerkonto, se tabel of Materials). Figur 1. Gating strategi bruges til at identificere alloreaktive Immune synapser. A. I-fokus hændelser gated fra alle begivenheder ved at gennemgå celle billeder baseret på den geometriske middelværdi af graden af ændring af billedet intensitet profil (Gradient RMS) ved hjælp af lysfelt channel (Channel 4, Ch04), som beskrevet i teksten. B. Blandt i fokus begivenheder, er dubletter skelnes fra enkelte celler ved at afbilde aspektforholdet versus område for lysfelt kanal. Enkelte celler er grupperet tæt på formatforhold på 1 og har et mindre område, mens dubletter er tæt på 0,5 og har et større område. C. Fluorescensintensitet af APC (i dette tilfælde, en dendritisk celle [DC] markering, CD11) afbildes derefter mod fluorescensintensitet af T-cellemarkør (i dette tilfælde, CD90.2), og dobbelt-positive begivenheder gated. Grænser for porten kan forfines ved at gennemgå billeder af begivenheder nær grænserne. D. T-APC dubletter derefter raffineret, således at de kun indeholder en APC ved at afbilde aspektforholdet versus område af APC markør (CD11, Ch02). E. Disse single-APC dubletter derefter raffineret, således at de kun indeholder en T-celle ved at afbilde billedformatet versus områdeaf T-cellemarkør (CD90.2, Ch06). F. Endelig begivenheder, der kun indeholder to kerner udvælges ved at plotte et histogram over stedet regne kernefarvemidlet kanalen (7-AAD, Ch05) og gating begivenheder, der indeholder kun 2 7-AAD-positive pletter (dvs. kerner). Begivenhederne i denne port analyseres for membran kontakt og synapsedannelse, som beskrevet i figur 2. Dataene blev analyseret på en blindet måde med hensyn til behandling opgave og er fra en tidligere publiceret eksperiment 23. Klik her for at se en større version af dette tal. BEMÆRK: gating strategi er beskrevet i dette afsnit og er afbildet i figur 1. Analyse af billeddannelse flowcytometri data bør udføres i en blindet måde med hensyn til behandling opgave. Selvom vi mener, at immun synapser og ikke-synaptic kontakter er generelt let skelnes (se nedenfor og figur 2 og 3), bør blændende minimere bias følge af subjektivitet til billedanalyse. Generer en kompensation matrix ved at indlæse de enkelt-pletten kontrol datafiler ind i kompensation guiden. Efter indlæsning de enkeltstrengede farves filer ved at vælge de fluorescerende kanaler, der anvendes i forsøget. BEMÆRK: Softwaren genererer automatisk en kompensation matrix, men dette bør manuelt valideres for at sikre, at de korrekte positive populationer blev udvalgt. Dobbeltklik på en værdi i matricen og tilsæt grafen til analysen område. Opret en ny port hvis det er nødvendigt for at udelukke eventuelle døde celler / dubletter / falske positiver; denne nye raffinerede positive population kan vælges i matricen boksen i drop down menuen for hver kanal. Gentag dette for hver kanal. Klik på "Afslut" for at gemme compensation-matrix (.ctm fil). Anskaf en dataanalyse fil (.daf) fra den rå fil (.rif) ved at indlæse den .rif fil i analysesoftware og anvende kompensation matrix. Når dataene er indlæst, udføre gating at identificere T-celle-APC kontakt begivenheder. BEMÆRK: En typisk gating strategi består i at identificere i-fokus begivenheder, vælge dubletter baseret på størrelse kriterier (det område kontra formatforhold begivenhed), og udvælgelse af T-celle-APC dubletter som begivenheder, der er dobbelt-positive for T-celle og APC markører (figur 1A-C). BEMÆRK: billedformat er forholdet mellem bredden af et arrangement for at dens højde, som tillader diskrimination af enkeltceller (forhold tæt på 1) fra dubletter (forhold tæt på 0,5). Identificere i-fokus begivenheder ved at plotte geometriske middelværdi af ændringshastigheden af den billeddannende intensitetsprofil (gradient RMS) i lysfelt kanal (figur 1A). Klik på the gradient RMS histogram at vise celle begivenheder i de enkelte beholdere og derefter placere en port eksklusive out-of-fokus begivenheder. Plot området versus formatforhold lysfelt kanal og trække en port, der identificerer dubletter baseret på begivenhed form og størrelse (figur 1B). Gennemgang af billeder af begivenhederne bare i og uden for grænsen af ​​denne port kan hjælpe analytikeren til at forfine porten størrelse og placering. Derefter konstruere et plot af disse dublet begivenheder, hvor intensiteten af ​​T-cellemarkør vises på en akse og intensiteten af ​​APC markør vises på den anden. Tegn en T-APC dublet gate som indeholder begivenheder positive for begge markører. Blandt de T-celle-APC dublet begivenheder, skal du vælge begivenheder, der kun indeholder én T-celle og en APC. Gøre dette ved at afbilde aspektforholdet versus område for APC markør og ved gating på dubletter indeholder en enkelt APC (figur 1D). Plot formatforholdet versus område for T-celle-mærketis og gate på dubletter indeholder en enkelt T-celle (figur 1E). BEMÆRK: Yderligere raffinering kan opnås ved at plotte et histogram over stedet tæller funktion som anvendt nuklear farvning fluorescens og gating på arrangementer med kun to pletter (figur 1F). I nogle tilfælde vil de to celler inden en dublet ikke være i kontakt; til at identificere celler i kontakt med hinanden, definerer objekt masker til APC'er og T-celler. Brug "Masker" i Analyse-menuen for at åbne Masker manager og definere en ny maske. Skriv et navn, såsom "T-celle objekt maske." Klik på "Function" knappen, og i dialogboksen, vælg "Object". Vælge den kanal, hvori detekteres T-cellemarkør (for eksempel Ch06). Klik på "OK". BEMÆRK: "Object (M06, Ch06, Tight)" vises i Function kassen. Denne standard objekt maske normalt works godt, men kan kræve optimering. Gentag denne proces for at skabe en APC objekt maske i den rigtige kanal. Efter identifikation APC og T-celle-masker, fastlægge membran kontakt ved at afbilde T-cellemarkør fluorescensintensitet i APC-objekt maske mod APC fluorescensintensitet i T-celle-objekt maske. På denne grund, tegne en port, der kun indeholder celler i kontakt med hinanden. BEMÆRK: Der er typisk temmelig klare dobbelt-positive og dobbelt-negative populationer (figur 2A). Grænsen mellem de dobbeltstrengede positive og dobbelt-negative populationer kan indstilles ved at gennemgå lysfelt billeder af celler i grænseregionen at sikre, at celler i kontakt er inden indgangen og at cellerne ikke er i kontakt, er udelukket. På dette stadium, manuelt gennemgå phalloidin FITC billeder af begivenheder inden for denne port til at skelne modne immune synapser fra simpel celle-celle kontakt. USE "tag billeder" funktion for at markere disse billeder. BEMÆRK: Procentdelen af mærkede begivenheder (immun synapser) inde denne port kan bruges som et indeks for direkte alloreaktivitet i T-celle population, der undersøges.

Representative Results

Denne fremgangsmåde blev anvendt til at undersøge CD4 + T-celle alloreaktivitet i mus gjort tolerante til donor alloantigener før heterotopisk hjerteallograft transplantation. CBA-mus (H-2 k) blev givet en tolerance-fremkaldende protokol består af en donor-specifik (B6, H-2b) blodtransfusion kombineret med et ikke-depletterende CD4-antistof en måned før modtagelse af en B6 hjertetransplantation. Denne protokol resulterer i langsigtet allotransplantatoverlevelse der er afhængig af Foxp3 + regulatoriske T-celler 36, 37. Syv dage efter transplantation, opnåedes milt CD4 + T-celler fra tolerante og ikke-tolerante modtagere af B6 hjerteallografter og blev co-inkuberet med B6 knoglemarvafledte DC'er ifølge denne protokol. Figur 2 viser repræsentative data fra dette forsøg. Membrankontaktstedet gate er vist i figur 2A, med grønne sigtekornet placeret på en synaptisk begivenhed (venstre panel, 1) og på et ikke-synaptisk begivenhed (højre panel). Figur 2B viser de lysfelt og fluorescenskanaler til denne begivenhed. At reducere skævhed blev data analyseret ved en observatør blindet for behandlingen opgave 23. Som vist i flere eksempler i figur 3, begge fra ikke-tolerancebehandlede (Figur 3A-B) og tolerante (figur 3C-D) CBA modtagere af B6 hjerter, synapser let skelnes fra ikke-synaptiske kontakter ved tilstedeværelsen af en tæt FITC-positiv højderyg ved T-APC-grænsefladen. Disse resultater viser, at visuel påvisning af immun synapser fra recipient-T-celler spor med graden af ​​alloreaktivitet i recipienten. Figur 2. Identifikation af T-APC Doublets med MembraneKontakt og Immune Synapse Formation. Begivenheder i den endelige dublet gate (figur 1F) analyseres. A. T-cellemarkør fluorescens i APC objekt masken er plottet mod APC markør fluorescens i DC objekt maske. Nogle dublet begivenheder har en APC og en T-celle uden celle-celle kontakt og vises i nederste venstre hjørne af plottet (billederne ikke vist). En kontakt membran gate kan således opstilles der kun indeholder dubletter, hvori T-celler og APC'er er i kontakt. Billeder af hver begivenhed i denne port gennemgås for tegn på actin cytoskeletal omlægning i phalloidin-FITC kanal og kan mærkes ved hjælp af analyse software. Det venstre panel viser en immun synapse begivenhed (mærket 1 og angivet ved grønne trådkors), mens det højre panel viser en kontakt membran begivenhed uden immun synapsedannelse (mærket 2 og angivet ved grønne trådkors). Bestemmelsen af ​​synapsedannelse kræver manuel gennemgang af dissebilleder, der er vist i B. B. Den øverste række viser lysfelt og fluorescens kanal billeder til en dublet med en immun synapse (svarer til begivenhed 1 i A); den nederste række viser en dublet med membran kontakt men mangler synapsedannelse (svarer til begivenheden 2 i A). Dataene blev analyseret på en blindet måde med hensyn til behandling opgave og er fra en tidligere publiceret eksperiment 23. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. Eksempler på T-APC Synapse Formation. CBA-mus modtog hjerteallografter fra B6 donorer efter enten ingen forbehandling (AB) eller efter toleranceinduktion med B6 helblod under dække af et ikke-depletterende anti-CD4-antistof ( <st Rong> CD). Efter 7 dage blev milt CD4 + -T-celler testet for synapsedannelse med B6 DC'er. A. Tre eksempler på ikke-synaptiske dubletter med membran kontakt fra en ikke-tolerant-gjort dyr. B. Tre eksempler på immun synapser fra en ikke-tolerancebehandlede dyr. C. Tre eksempler på ikke-synaptiske dubletter med membran kontakt fra en tolerant-gjort dyr. D. Tre eksempler på immun synapser fra en tolerancebehandlede dyr. Synapsedannelse er indikeret ved tilstedeværelsen af ​​et lyst, FITC-positiv højderyg ved T-APC-grænsefladen (Ch03). Dataene blev analyseret på en blindet måde med hensyn til behandling opgave og er fra en tidligere publiceret eksperiment 23. Klik her for at se en større version af dette tal. ays "> Antistof / Dye fluorokrom Kanal Koncentration CD11 eF450 Ch02 5 ug / ml, titreres empirisk CD90.2 APC Ch06 5 ug / ml, titreres empirisk phalloidin FITC Ch03 0,05 – 0,5 ug / ml 7-AAD – Ch05 25 pg / ml Tabel 1. Antistoffer og farvestoffer, der anvendes i denne undersøgelse. Fluorokromkonjugerede antistoffer, farvestoffer, leverandører og anbefalede koncentrationer er vist i tabellen. Det billeddannende flowcytometer kanal, der blev anvendt til at detektere hver fluorochrom er også vist i tabellen.

Discussion

Billeddannelse flowcytometri er blevet anvendt til at påvise immun synapsedannelse mellem monoklonale T-celler og APC'er eller i nærvær af superantigener 24, 25, 26, 27, 28. Denne fremgangsmåde drager fordel af det faktum, at efter en produktiv T-celle-APC kontakt, T-cellen omarrangerer sin aktincytoskelet, polariserende den mod kontaktstedet 21. Denne omlejring forekommer ikke uden TCR-signalering, og det er derfor en tidlig korrelat af T-celleaktivering 19, 20, 21. Den her præsenterede fremgangsmåde tilpasser denne fremgangsmåde til måling af alloreaktive T-celle frekvens i polyklonale T-cellepopulationer. Som sådan kan det i fremtiden danne grundlag for udvikling af assays til donor reactivi ty i klinisk transplantation.

Selvom direkte sammenligninger er endnu ikke blevet gjort, påvisning af alloreaktive immune synapser synes at have overlegen forudsigende effekt end den konventionelle MLR. For eksempel har tidligere arbejde vist, at i den toleriserende ovenfor beskrevne protokol, resultaterne af en MLR ikke pålideligt korrelere med graft resultatet 2.

Et antal assays er blevet udviklet til operationelt tolerante tilstand hos mennesker 9, 10, 11, selv om disse ikke måler effektorcelle-funktion som reaktion på alloantigen. I modsætning hertil IFNy ELISPOT-analyser 8 foranstaltning effektor-T-celle-funktion, men kan ikke indfange hele spektret af cytokinsekretion, som kan være relevante for akut og kronisk allotransplantatafstødning, såsom IL-17 38,> 39. Den begrænsende fortynding assay 4, som er arbejdskrævende, og trans-vivo-assay 6, som kræver mus, har betydelige praktiske begrænsninger, der vil hindre deres anvendelse i et klinisk miljø. Nylige forbedringer på analysen af prolifererende celler under anvendelse TCR-sekvensanalyse af T-celler reagerer i MLR, kan være af værdi, men ligesom assayet præsenteres her, vil kræve yderligere validering i kliniske studier 18, 40.

Videreudvikling af immunsystemet synapse detekteringsanalyse vil kræve, at en række vigtige spørgsmål besvares. Først analysen som udviklede måler kun direkte alloreaktivitet. Den direkte vej involverer præsentation af allogene MHC / peptid-komplekser på donorafledte APC'er. Sidstnævnte er generelt elimineret hurtigt efter transplantation, og yderligere alloantigen præsentation er Carried af modtagerens APC'er præsentere intakt donor MHC (todelt direkte pathway) eller forarbejdet donorantigener på self MHC (indirekte pathway). Den indirekte vej er en vigtig drivkraft for kronisk allograftafstødning 33, 41.

I princippet burde det være muligt at påvise indirekte immun synapser ved hjælp af denne analyse, men indirekte alloreaktive T-celler har en meget lavere frekvens end direkte dem 42, 43, hvilket betyder, at der kræves en analyse af et større antal hændelser. En anden overvejelse er, at vi kun har testet denne assay under anvendelse af CD4 + T-celler, hvorimod CD8 + T-celler er også en vigtig bestanddel af anti-donor-respons. Igen skal det være muligt at detektere CD8 + T-celle-APC synapser hjælp af denne metode. En anden begrænsning er, at metoden kræver manuel gennemgang og analyse af celle- billeder i den endelige membrane kontakt gate, og vi arbejder i øjeblikket på automatisering af dette trin.

Endelig kræver fremgangsmåden test og udvikling hos mennesker, og de foreløbige undersøgelser med humane prøver i øjeblikket udføres. Yderligere fænotypiske T-celle delmængde analyse (dvs. effektor, hukommelse, regulerende, etc.) i kombination med påvisning af immun synapser i transplantatmodtagere ville repræsentere en kraftfuld fremgangsmåde til karakterisering af alloreaktive T-celle repertoire og vil være et vigtigt fokus for fremtidige arbejde.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SCJ blev understøttet af en International Society for Heart og Lung Transplantation Research Fellowship og en Royal College of Physicians og kirurger i Canada Detweiler Travelling Fellowship.SM blev delvist understøttet af en International Society for hjerte og lunger Transplantation Karriereudvikling Award (til SCJ). SS blev støttet af National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH er modtageren af ​​en Nyre Research UK Erfaren ikke-kliniske Fellowship. Dette arbejde blev finansieret af de følgende tilskud til AB og KW: en Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), en British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504), og EU-rammeprogram 7 (én undersøgelse, BioDRIM). Forfatterne vil gerne takke Michael Parsons og flowcytometri Core facilitet på Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto for at give adgang til og støtte med ImageStream Mark X instrument.

Materials

Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Tags

T Cell AlloreactivityImaging Flow CytometryTransplant ImmunologyDendritic CellsT CellsCell-cell InteractionsFluorescent MicroscopyFlow CytometryCell CultureFixationStainingPerm/wash BufferNuclear DyeBrightfield Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image