マウスリンパ球標識による<sup> 64</sup以下のためのターゲット設定>のCu-抗体の受容体<em>インビボ</em> PET / CTによる細胞輸送
Summary
生存能力、機能、ラベリング安定性およびアポトーシスについて分析し、そして養子気道遅延型過敏症を有するマウスに移し、トランスジェニックマウスのT細胞受容体に結合する64のCu修飾モノクローナル抗体の調製後、T細胞は、in vivoで放射性標識されています陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）によって非侵襲的イメージングのための反応。
Abstract
このプロトコルは、64 Cuおよびマウスリンパ球細胞培養および細胞の標的64のCu-抗体受容体続いモノクローナル抗体（mAb）のキレート剤結合体/放射性標識の製造を示します。 PET / CTによって過敏反応（DTHR）型遅延気道の動物モデルにおけるインビボ細胞追跡における放射性標識および非侵襲性のインビトロ評価に記載されています。
詳細には、キレート剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）とのmAbの結合が示されています。放射性64のCuの製造以下、DOTA共役mAbの放射性標識が記載されています。次に、ニワトリオボアルブミンの膨張（コバ）特異的CD4 +インターフェロン（IFN）-γを産生するTヘルパー細胞（コバ-TH1）とコバ-TH1細胞のその後の放射標識が示されています。様々なインビトロ技術は、EFを評価するために提示されていますフローサイトメトリーのために、トリパンブルー排除により、細胞生存率の決意のような細胞上の64のCu-放射標識のfects、アネキシンVとアポトーシスの染色、およびIFN-γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）による機能の評価。さらに、細胞内への放射性取り込みおよび標識安定性の決意は、詳細に記載されています。このプロトコルは、更に、従って、BALB / cマウスにおけるコバ誘発性急性気道DHTRの誘導が含まれる、気道DTHRの動物モデルにおける細胞追跡研究を実行する方法について説明します。最後に、画像収集、再建、および分析を含む強固なPET / CTのワークフローが提示されます。
その後の受容体内在64のCu-抗体受容体標的化アプローチは、細胞標識のための一般的なPET-トレーサーと比較して高い特異性および安定性、低下細胞毒性、及び低い流出速度を提供し、例えば 64銅-pyruvaldehydeビス（N4メチルチオ）（64のCu-PTSM）。最後に、我々のアプローチは、48時間、最適な信号対バックグラウンド比PET / CTによってインビボ細胞追跡に非侵襲可能。この実験的アプローチは、内在化された膜結合型受容体とは異なる動物モデルおよび細胞型に転送することができます。
Introduction
非侵襲性細胞の追跡は、in vivoで細胞機能、遊走及びホーミングを監視するための多目的なツールです。最近の細胞追跡研究は再生医療、がん3、4に対する養子細胞療法における炎症またはTリンパ球における自己末梢白血球の文脈では、間葉系1、2または骨髄由来幹細胞3に焦点を当てています。作用部位および細胞ベースの治療の基本的な生物学的原則の解明は途方もない重要です。 CD8 +細胞傷害性Tリンパ球、遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（CAR）T細胞または腫瘍浸潤リンパ球（TILを）が広くゴールドスタンダードと考えられました。しかしながら、腫瘍関連抗原特異的Th1細胞は、<、有効な代替治療選択肢4であることが証明されています/ SUP> 5、6、7。
炎症におけるキープレーヤー、器官特異的自己免疫疾患（ 例えば 、慢性関節リウマチや気管支喘息）、および癌免疫療法における関心の高い細胞としては、TH1細胞の時間的分布とホーミングパターンを特徴付けることが重要です。 PETによる非侵襲性インビボイメージングは、in vivoホーミングにおいて 、細胞遊走パターンを調べるために、定量的、高感度法8を提示し、炎症、アレルギー、感染または腫瘍拒絶9、10、11の間にT細胞作用および応答の部位。
臨床的には、インオキシン111は 、2-デオキシ-2-（18ながら、炎症及び感染12の識別のための白血球シンチグラフィーのために使用されますF）フルオロ-D-グルコース（18 F-FDG）は、一般にPET 3,13によって細胞追跡研究のために使用されます。このPETトレーサーの1つの主要な欠点は、しかし、109.7分で放射性核種18 Fと後の時点でイメージングは養子細胞移入を投稿妨げ低細胞内安定性の半減期が短いです。細胞中で不安定であるがPETによるインビボ細胞追跡研究における長期のために、64のCu-PTSMは、しばしば非特異的T細胞生存率に対する最小に有害な影響を有するセル14、15をラベル16を機能するために使用されます。
このプロトコルは、さらに、T細胞受容体（TCR）に特異的な放射性標識モノクローナル抗体を用いて細胞生存率および機能に不利な影響を低減する方法が記載されています。まず、放射性同位体64にCu、THとのmAb KJ1-26のコンジュゲートの製造Eキレート剤DOTA、およびそれに続く64のCu-放射標識が示されています。第二ステップでは、単離およびDO11.10ドナーマウスのコバ-TH1細胞の増殖及び64のCu-ロードDOTA-結合mAb KJ1-26（64のCu-DOTA-KJ1-26）による放射性標識は、詳細に記載されています。それぞれ線量キャリブレータを有するとγカウンティングによる取り込み値と放射能の流出の評価、ならびにIFN-γELISAでトリパンブルー排除および機能によって細胞生存率に対して64のCu-放射標識の効果の評価が提示されます。 インビボ細胞追跡に非侵襲のために、養子細胞移入後のPET / CTによるコバ誘発性急性気道DTHRと画像取得のマウスモデルの誘発が記載されています。
また、この標識アプローチは、異なる疾患モデル、別のTCR又は膜結合受容体又は発現MARを関心のある一般的な細胞とマウスT細胞に伝達することができますKERSは、連続膜17を往復の基礎となります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは安定PETによるインビボ追跡のために、細胞を放射標識するための信頼性と簡単な方法を提示します。この方法を利用し、ドナーマウスから単離し、in vitroで増殖コバ-TH1細胞は、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbで放射性標識することができ、それらのホーミングがでコバプレゼンテーションの部位として肺およびperithymic LNSに追跡しました。コヴァ誘発性急性気道DTHR。…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、実験とデータ分析の際に支援するために博士はジュリア・マンハイム、ウォルター・エリッチマン、ラモナシュトゥンム、Fundaケイ、ダニエル・ブカラ、マレン・ハラントだけでなく、ナタリー・アルトメイヤー感謝します。この作品は、SFB685（プロジェクトB6）と富（2309-0-0）を通じてヴェルナーシーメンス財団、DFGによってサポートされていました。
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
Referenzen
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