Snelle verwijdering Productie in Fungi via<em> Agrobacterium</em> Gemedieerde Transformatie van OSCAR Deletion Constructs
Summary
Gen deletie mutanten gegenereerd door homologe recombinatie zijn de gouden standaard voor genfunctie studies. De OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) methode voor snelle generatie van deletieconstructen wordt beschreven. Agrobacterium gemedieerde schimmel transformatie volgt. Tenslotte wordt een PCR-gebaseerde bevestigingsmethode van gendeleties in zwamtransformanten gepresenteerd.
Abstract
Een nauwkeurige deletie van genen die van belang zijn, terwijl de rest van het genoom onveranderd wordt, biedt het ideale product om de functie van het bepaalde gen in het levende organisme te bepalen. In dit protocol wordt de OSCAR methode beschreven voor nauwkeurige en snelle deletie plasmide constructie. OSCAR berust op het kloningssysteem waarin een enkele recombinase-reactie wordt uitgevoerd die de gezuiverde PCR-geamplificeerde 5 'en 3' flanken van het gen van belang en twee plasmiden, pA-Hyg OSCAR (de markervector) en pOSCAR bevat vector). Bevestiging van de correct samengestelde deletievector wordt uitgevoerd door middel van restrictie-digestie-mapping, gevolgd door sequencing. Agrobacterium tumefaciens wordt dan gebruikt om de introductie van het deletieconstruct in schimmelsporen te bemiddelen (aangeduid als ATMT). Tenslotte wordt een PCR-analyse beschreven om te bepalen of het deletieconstruct geïntegreerd is door homologe of niet-homologe recombinatie, welke gendeletie ofEctopische integratie, respectievelijk. Deze aanpak is succesvol gebruikt voor de verwijdering van talrijke genen in Verticillium dahliae en in Fusarium verticillioides onder andere soorten.
Introduction
Genetische dissectie is een krachtige methodologie voor het bepalen van het functionele belang van individu of combinaties van genen. Een standaardbenadering om de rol van specifieke genen te begrijpen is de productie van enkele genmutanten ongewijzigd in elk ander gen. De meest krachtige en minst potentiële confounding benadering is compleet en precies deletie van het open lezingsgedeelte van een gen van interesse (GOI ORF) zonder schade aan een andere genfunctie.
Omdat standaardligatiebenaderingen voor het verwijderen van plasmide-generatie meerdere stappen vereisen, zou de rationele voor OSCAR 1 een snellere in vitro- aanpak produceren. Figuur 1 toont het assemblageproces in de OSCAR-aanpak. De hier beschreven werkwijze heeft het voordeel van het combineren van snelle constructie van individuele gendeletievectoren in een enkele multipartreactie in combinatie met daaropvolgende Agrobacterium tumefaciens gemedieerde transfoRmation (ATMT). OSCAR is zeer snel en vergelijkt goed met andere strategieën, zoals het gebruik van Gibson assemblage in gist 2 . De OSCAR-methode is succesvol gebruikt bij verscheidene Ascomycota soorten schimmels. Deze soorten omvatten: Fusarium verticillioides (ongepubliceerd), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 en Dothistroma septosporum 9 en Sarocladium zeae (ongepubliceerd) .
Dit protocol geeft stap-voor-stap instructie voor de methode inclusief primerontwerp, flank-PCR-amplificatie, de OSCAR BP-reactie, de bevestiging van de verwijdering van constructstructuur, transformatieIonen van Agrobacterium met het construct gevolgd door ATMT-gebaseerde overdracht van het deletieconstruct in de schimmelcellen en uiteindelijk differentiëren van schimmeldeletiemutanten van die met ectopisch geïntegreerde deletieconstructen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een stapconstructie van Agrobacterium -Recombinatie-ready-plasmiden (OSCAR) is met succes toegepast bij een steeds groter aantal Ascomycota-schimmels. De methode zou ook gemakkelijk van toepassing kunnen zijn op de Basidiomycota en soorten van andere schimmelfyla (met geschikte promotoren die selecteerbare merkergenen aandrijven), waarbij Agrobacterium gemedieerde transformatie en homologe recombinatie mogelijk zijn. Er zijn extra markeringsvectoren gegenereerd om keuzes van anti-schimmelverbindingen t…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de volgende leerlingen van de lagere en middelbare school voor hun werk om OSCAR mutanten te genereren in Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le en Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referenzen
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
