Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die für Delphin Spermien Sammlung, Kryokonservierung und heterologen IVF-Leistung mit boviner Oozyten erfolgreich eingesetzt haben.
Abstract
Die Verwendung von kryokonservierten Delphin Spermien erleichtert den Austausch genetischen Materials zwischen Wasserparks und Spermien für Laboratorien für Studien zu unserem Verständnis der Meeressäuger Reproduktion weiter zugänglich macht. Heterologe IVF, Ersatz für homologe IVF, könnten ein Mittel, um die Spermien Fruchtbarkeit potenzielle testen; Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren; und die Verwendung von wertvollen Delphin Eizellen zu vermeiden, die schwer zu erhalten sind. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die erfolgreich eingesetzt haben, zu sammeln und Tiefgefrieren Delphin Spermien. Die Sammlung des Samens erfolgt durch manuelle Stimulation über ausgebildete Delphine. Die Kryokonservierung wird erreicht mit einem TRIS-Eigelb-Basis-Extender mit Glycerin. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, beschreibt heterologen IVF mit Delphin Spermatozoa und boviner Oozyten und, überprüft die hybride Natur des entstehenden Embryos mittels PCR. Heterologen Befruchtung wirft Fragen auf Düngung und kann als Werkzeug verwendet werden, um die Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren. Darüber hinaus zeigt sich der Erfolg der heterologen IVF das Potential dieser Technik Delphin Sperma Düngung Kapazität, die weitere Prüfung lohnt zu testen.
Introduction
Techniken der assistierten Reproduktion sind schlecht in wilde Tiere, einschließlich Meeressäugern entwickelt. Der Mangel an sensiblen Verfahren zur Beurteilung der Spermien Düngung Erfolg trägt zu der langsamen Entwicklung der reproduktiven Technologien in Arten wie Delphin. Es war nicht bis vor kurzem, dass die bahnbrechenden Grundparameter der Große Tümmler (Tursiops Truncatus) gemeldeten1,2. Variablen wie Motilität und Morphologie, geben obwohl weit verbreitet, jedoch nur begrenzte Informationen über reproduktive Effizienz. Der beste Indikator für die Qualität der Spermien ist die Düngung Potenzialbeurteilung.
Vor kurzem herangezogen unsere Fraktion eine Methode zur Delphin Sperma Düngung Potenzial durch die Beurteilung der männlichen man Bildung und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten3Beurteilung. Die Verwendung von Delphin-Rind heterologen IVF hat wichtige Vorteile gegenüber dem homologen IVF, wie es die Schwierigkeit, Delphin Eizellen überwindet und erleichtert die Verwendung von bewährten in Vitro boviner Oozyten Reifung Systeme. Zur Vermeidung von Arten Spezifität erfolgt in der Regel heterologen Befruchtung bei fehlender ZP. Obwohl es für die Bewertung der Fähigkeit von Akrosom reagierte Spermien mit der Dotterhäutchen Membran verschmelzen kann, beeinträchtigt es die Bewertung der anderen Features, die im Zusammenhang mit der Befruchtung. Das beschriebene Verfahren Zona intakte Eizellen verwendet und ermöglicht die Auswertung der folgenden Parameter: Sperma Zona Bindung und Anhaftung, eindringen, Polyspermy, man Bildung und hybride Embryo Spaltung.
Hier präsentieren wir Ihnen verschiedene Protokolle zur Spermiengewinnung, grundlegende Spermiogramm, Spermien Einfrieren sowie die Auswertung der Delphin-Sperma-Funktionalität durch die Beurteilung der männlichen man und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für viele verschiedene Säugetierarten gibt es vielfältige Vorteile bei der Verwendung von aufgetauten Spermien. Dazu gehören die Fähigkeit übertragen wertvolles genetisches Material, das Potenzial für den weltweiten Vertrieb, das geringe Risiko der Kontamination und die Fähigkeit, die männlichen Gameten für Jahrzehnte zu bewahren. Die Verwendung von kryokonservierten Spermien gilt der Große Tümmler, da diese Spezies unter Anhang II des Washingtoner ARTENSCHUTZÜBEREINKOMMENS, geschützt ist, was den Transport…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
seine Arbeit wurde durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (AGL2015-70140-R, D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan und J. F. Pérez-Gutiérrez und Seneca Stiftung von Murcia (Grant 20040/GERM/16, F. García-Vázquez) finanziert.
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
Referenzen
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