خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية
Summary
هنا، نقدم نهج كومبيناتوريال لتصنيف أنواع الخلايا العصبية قبل العزلة ولتوصيف لاحقة من ترانسكريبتومس أحادية الخلية. هذا البروتوكول يحسن إعداد عينات لنجاح تسلسل الحمض النووي الريبي (رنا-سيق) ويصف منهجية مصممة خصيصا لتعزيز فهم التنوع الخلوي.
Abstract
اكتشاف علامات نوع الخلية محددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة الخلوية وأصول التجانس الخلوي. مع دفعة مؤخرا لتحسين فهم التنوع العصبي، من المهم تحديد الجينات التي تعبر عن تعريف مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا. الشبكية بمثابة نموذج ممتاز لدراسة التنوع في الجهاز العصبي المركزي، لأنها تتكون من عدة أنواع الخلايا الرئيسية. وقد أسفرت دراسة كل فئة رئيسية من الخلايا علامات الوراثية التي تسهل تحديد هذه المجموعات السكانية. ومع ذلك، توجد أنواع فرعية متعددة من الخلايا داخل كل من هذه الطبقات الخلايا الشبكية الرئيسية، وعدد قليل من هذه الأنواع الفرعية لها علامات وراثية معروفة، على الرغم من أن العديد قد تميزت مورفولوجيا أو وظيفة. ومن شأن معرفة العلامات الجينية لأنواع الشبكية الفردية أن تسمح بدراسة ورسم خرائط لأهداف الدماغ المتعلقة بوظائف بصرية محددة، كما يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة على شبكات الجينات التيالحفاظ على التنوع الخلوي. الطرق الحالية المستخدمة لتحديد علامات وراثية من الأنواع الفرعية تمتلك عيوب، مثل تصنيف أنواع الخلايا التالية التسلسل. هذا يمثل تحديا لتحليل البيانات ويتطلب أساليب التحقق من صحة صارمة لضمان أن مجموعات تحتوي على خلايا من نفس الوظيفة. نقترح تقنية لتحديد مورفولوجيا ووظائف الخلية قبل العزلة والتسلسل، والتي سوف تسمح لتسهيل تحديد علامات النوع الفرعي. ويمكن أن تمتد هذه التقنية إلى أنواع الخلايا غير العصبية، فضلا عن السكان النادرة من الخلايا مع اختلافات طفيفة. هذا البروتوكول يعطي بيانات ذات نوعية ممتازة، كما قدمت العديد من المكتبات أعماق قراءة أكبر من 20 مليون يقرأ للخلايا واحدة. هذه المنهجية يتغلب على العديد من العقبات التي تقدمها خلية واحدة رنا-سيق وقد تكون مناسبة للباحثين تهدف إلى تعريف أنواع الخلايا بطريقة واضحة وفعالة للغاية.
Introduction
ويلاحظ التنوع العصبي في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في شبكية العين الفقارية، الأنسجة المتخصصة للغاية تتكون من 1 الدبقية و 6 أنواع الخلايا العصبية التي تنشأ من عدد واحد من خلايا السلف الشبكية 1 ، 2 ، 3 . يمكن تصنيف العديد من الأنواع الفرعية من الخلايا وظيفيا، شكليا، وراثيا. الهدف من هذا البروتوكول هو لربط التباين الوراثي لأنواع الخلايا لخصائص وظيفية و / أو المورفولوجية يمكن التعرف عليها. وقد تم تحديد عدد من الجينات لتصنيف الخلايا، ولكن العديد من الأنواع الفرعية لا تزال تذهب غير معهود، لأنها تمثل جزءا صغيرا من مجموع السكان. وتحديد الجينات داخل هذه الأنواع الفرعية محددة تسمح لفهم أكبر للتنوع الخلايا العصبية داخل شبكية العين، ويمكن أيضا تسليط الضوء على تنويع الخلايا العصبية في مكان آخر. فورثرمور، دراسات خلية واحدة تسمح للكشف عن أنواع الخلايا الجديدة، والتي قد تم تجاهلها بسبب انخفاض تمثيلها بين مجموع السكان 4 ، 5 ، 6 ، 7 .
واحدة من فوائد ترانسكريبتوميكس خلية واحدة هي أن علامات فريدة من نوعها أو مجموعات من علامات التي تحدد نوع فرعي الخلوية معينة يمكن اكتشافها. ويمكن بعد ذلك استخدامها للحصول على الوصول الجيني إلى هذا النوع من الخلايا لالتلاعب مختلفة. على سبيل المثال، نحن نستخدم هذا البروتوكول لتوصيف الجينات نوع معين من الخلايا من مجموعة فرعية من خلايا العقدة الشبكية التي تعبر عن ميلانوبسين فوتوبيغمينت. استخدام علامة الفلورسنت في ميلانوبسين معربا عن خلايا الشبكية العقدة تمكن دراسة هذه الخلايا، كما يتم تجميعها معا بسبب التعبير عن الجين المعروف. ومن المثير للاهتمام، هناك خمسة أنواع فرعية معروفة من هذه الخلية بوبولاتيون في شبكية العين الماوس 8 . وهكذا، من أجل عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا من كل نوع، استخدمنا تصنيفات المورفولوجية المنشأة ضمن نموذج المعدلة وراثيا لتحديد كل نوع فرعي قبل عزل الخلية. هذه التقنية تسمح لتوصيف الخلايا وكذلك لعزلتها مباشرة من شبكية العين، من دون الحاجة إلى تفكك الأنسجة، والتي قد تسبب استجابة الإجهاد داخل الخلايا والتلوث بسبب قطع التشعبات 9 .
وقد ظهرت العديد من التقنيات الجديدة في السنوات القليلة الماضية مع استمرار تطور طريقة رنا-سيق. هذه الأدوات تسمح للحصول على أقصى قدر من اكتساب الخلايا وكفاءة أكبر من حيث التكلفة في حين تقترب من السؤال في متناول اليد 4 ، 7 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . ومع ذلك، في حينوكانت هذه التقنيات ممتازة يخطو الحجارة، وهناك عدد من العقبات لا تزال تواجه أن هذا البروتوكول هو قادرة على معالجة. أولا، العديد من الإجراءات الحالية عزل الخلايا من الأنسجة فصل ومحاولة استخدام إما تحليل المكون الرئيسي أو التكتل الهرمي بعد مخصصة لتحديد تصنيف الخلية. الاعتماد على هذه الأدوات لتصنيف الأنواع الفرعية قد لا تنتج نتائج موثوقة وقد تجبر واحد على إيجاد طرق جديدة للتحقق من صحة هذه البيانات لربط علامة وراثية لنوع خلية وظيفية. شرط التفكك في بروتوكولات أخرى يمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى تلف الأنسجة ويمكن أن يسبب قطع الخلايا العصبية إلى قطع، مما أدى إلى خسارة محتملة من مرنا. وعلاوة على ذلك، في الاستعدادات خلية فصلها، قد تبدأ ردود الإجهاد تؤثر على ترانسكريبتوميس من هذه الخلايا 14 . هذا البروتوكول يتغلب على هذه التحديات من خلال تحديد نوع خلية وظيفية قبل العزلة، ويحافظ على أفضل حثروة الخلايا عن طريق الحفاظ على أنسجة الشبكية سليمة.
تم إدخال تقنية واحدة في عام 2014، وتتألف من تحليل في الجسم الحي من ترانسكريبتوم من الخلايا الحية 15 . في حين أن هذه التقنية تسمح لفحص ترانسكريبتوم مع الحد الأدنى من تعطيل الميكانيكية للأنسجة، فإنه يفتقر إلى القدرة على تصنيف أنواع محددة من الخلايا داخل الأنسجة قبل فحص ترانسكريبتوميس دون استخدام الماوس مراسل محدد جدا. بروتوكولنا لا يتطلب مراسل معين، ونحن الاستفادة من ملء الخلايا والفيزيولوجيا الكهربية لتوصيف الخلايا قبل عزلتها. قيود أخرى من هذا البروتوكول السابق هو أنه يتطلب الطول الموجي محددة لإثارة عنصر فوتواكتيفابل، في حين يسمح بروتوكول لدينا لاستخدام مراسل الفلورسنت وصبغ الفلورسنت، والتي هي متاحة بسهولة أو يمكن اختيارها من قبل كل مختبر على حدة. ومع ذلك، تزوجت مختبرات أخرى طريقتين من الكهرباءالفسيولوجيا و ترانسكريبتوميكس لدراسة التنوع الخلوي. وقد تم استخدام التسجيلات التصحيح المشبك لوصف وظيفة خلية قبل عزلتها على الخلايا العصبية فصل 16 ، وفي بعض الحالات، وقد سبقت استخدام تحليل ميكروأري 17 لهذه الدراسات. نفس المضاعفات التي واجهتها تلك النهج، لأنها تتطلب تفكك الأنسجة أو استخدام التكنولوجيا ميكروأري، والتي تعتمد على التهجين من العينات إلى تحقيقات المتاحة. وكان واحدا من أحدث التطورات تطوير البقعة-سيق، وهي تقنية تجمع بين استخدام التسجيلات المشبك التصحيح والتكنولوجيا رنا-سيق لفهم الخلايا من شرائح الدماغ كله 18 . في حين أن هذه التقنية له أوجه التشابه مع بروتوكول المعروضة هنا، فمن المهم مرة أخرى أن نلاحظ أن نهجنا يسمح للأنسجة لتبقى سليمة لصحة الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول ل أوبتيميزاتأيون من هذا التحالف، الذي يولد مكتبات ذات خلية واحدة عالية الجودة لاستخدام رنا-سيق للحصول على عمق قراءة عالية ورسم الخرائط التغطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكولنا يوضح، من خلال دليل سريع وسهل الاستخدام، وسيلة لإعداد خلايا واحدة من الطبقات المورفولوجية المحددة للتسلسل ذات جودة عالية، مع إصابة ضئيلة للعينة. في المخطوطة الحالية، وتتميز الخلايا العصبية في شبكية العين حساس في جوهرها بشكل مورفولوجيا، معزولة، وعلى استع…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف جنيفر بير وإينات سنير، وكذلك جامعة معهد ولاية ايوا لعلم الوراثة البشرية، لمساعدتهم في إعداد ومعالجة العينات.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
Referenzen
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
