Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Na pesquisa médica, muita atenção está focada em proteínas de membrana, quer intrínsecos ou extrínsecos, envolvidos em uma variedade de interações lipídicas. Trabalhando com proteínas interactuantes de lípidos inclui quer seleccionando um substituto para os lípidos, tais como detergentes, amphipols ^1, ou ² pequenas proteínas, ou encontrar um substituto membrana que mantém a proteína solúvel e activa. Substitutos de membrana lipóico incluem lipossomas e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs são plataformas de membrana de quase-nativos desenvolvidos por engenharia a parte de proteína, ApoA-1, da lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue que ocorrem naturalmente. ApoA-1 é um resíduo 243 ao longo da cadeia de curtas hélices a anfipáticas e tem uma conformação solúvel livre de lípidos. In vitro, quando na presença de lípidos, duas cópias da proteína de ApoA-1 espontaneamente rearranjar para rodear o hidrporção da cadeia acil ophobic de um lipídico remendo bicamada ^5. versões modificadas de ApoA-1 são geralmente chamadas proteínas de membrana de andaime (MSP), e um número crescente estão comercialmente disponíveis como plasmídeos ou como proteínas purificadas. Repetições ou deleções das hélices em ApoA-1 resultam em proteínas de membrana de andaimes ^{7 6} mais longos ou mais curtos. Isto por sua vez faz com que seja possível formar discos de cerca de 6 nm ⁷ a 17 nm de diâmetro ^8. Existem diferentes tipos de aplicações para o nanodiscs ^{3, 9.} A aplicação mais vulgarmente utilizado é o de proporcionar um ambiente de membrana quase nativo para a estabilização de uma proteína de membrana integral ^8, avaliação previamente ^{3, 9.} Uma utilização menos explorado é proporcionar uma superfície de membrana para o estudo nanoescala demembrana periférica proteínas ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Seção 1 do protocolo abaixo visualiza o procedimento para fazer nanodiscs compostos de fosfolipídios e proteínas andaimes membrana.

A preparação da amostra é um gargalo na maioria dos métodos. amostras específicos do método pode adicionar informações particular, mas também fazer comparações de resultados difícil. Portanto, é mais simples quando as amostras são multimodais e pode ser utilizado directamente em vários métodos diferentes. Uma vantagem com a utilização de nanodiscs é o tamanho pequeno do nanodisc em comparação com lipossomas (por exemplo, as amostras podem ser utilizados directamente para ambos TEM e electroforese em gel não desnaturante, tal como no presente protocolo).

<p class = "jove_content"> vesículas e lipossomas têm sido muito utilizados para compreender a função de proteínas que interagem com membrana. Para os estudos estruturais e de visualização, um exemplo da determinação estrutural de uma proteína transmembranar em lipossomas está disponível ^18. No entanto, nenhuma estrutura 3D de alta resolução de uma proteína de membrana monotópico incorporado em uma membrana de lipossoma ainda não foi publicada, tanto quanto sabemos. As nanopartículas de ouro ou anticorpos pode ser utilizada para visualizar as proteínas de ligação a lipossomas ou vesículas usar o sistema ^19. Mesmo que estas sondas são muito específicos, eles podem interferir com as proteínas de ligação membrana velando o local de ligação da membrana ou mascarando áreas de interesse com as partes flexíveis. Ouro-marcado ou proteínas complexado com anticorpo poderia provavelmente ser analisados ​​num gel, mas isto iria aumentar o custo do experimento.

Embora lipossomas são uma excelente plataforma, não se pode ter certeza de que o popmento tem uma razão particular de proteína por lipossoma, uma característica que pode ser explorado pela utilização de nanodiscs ^20. Em um lipossoma, cofactores e substratos pode ser preso no interior solúvel. Substâncias que são membrana solúvel irá compartilhar o mesmo destino para os dois tipos de miméticos de membranas. No entanto, como a área de bicamada é menor em nanodiscs, uma quantidade menor de substância é necessária para saturar as membranas nanodisc.

a função da proteína compreensão através da determinação da estrutura atômica tem sido essencial para muitos campos de pesquisa. Os métodos para determinação de estruturas de proteínas incluem raios X ^21; ressonância magnética nuclear (RMN) ^{de 22, 23;} e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ²⁴ em temperaturas criogênicas, cryoEM. A resolução por cryoEM ultimamente tem sido muito melhorada, principalmente devido ao uso de elétrons de diretaTectors ^{25, 26.} As macromoléculas são gravadas em fina, gelo vítreo ²⁷ em um estado quase nativo. No entanto, devido ao baixo contraste de moléculas biológicas, tornam-se difíceis de detectar na gama de tamanhos de 100-200 kDa. Para as amostras de tamanho adequado, recolha de dados pode ser feita, e o método de reconstrução única partícula pode ser aplicado para se obter uma estrutura ^28.

No entanto, a determinação da estrutura da proteína por MET é um processo de múltiplos passos. Geralmente começa com a avaliação de monodispersity amostra por-coloração negativa TEM ²⁹ usando sais de metais pesados como phosphotungsten (PT) ³⁰ ou urânio ^31. Reconstrução de um modelo de baixa resolução da macromolécula negativamente corada é geralmente feito e pode fornecer informações importantes sobre a estrutura molecular ^29. Em paralelo,recolha de dados usando cryoEM pode começar. Cuidados devem ser tomados quando se avaliam dados TEM-mancha negativa para evitar a má interpretação da formação de artefato. Um artefacto particular é o efeito da mancha PT em fosfolípidos e lipos somas ^{de 32,} resultando na formação de longas hastes que se assemelham a pilhas de moedas visto de lado ^33. Tal "rouleau" ou "pilhas" (doravante denominada como "pilhas") foram observados no início de HDL ^34, e mais tarde também para nanodiscs ^35.

O empilhamento e reformulação das membranas pode ocorrer por várias razões. Por exemplo, pode ser induzida por co-factores, como o cobre, mostrado por imagem TEM de uma mancha de molibdato de amónio ^36. Uma fracção dos lípidos de membrana em liposomas continha um grupo de cabeça de ácido iminodiacético imitando complexação de metais por EDTA, empilhamento, portanto, os lipossomas após a adição de iões de cobre <s-se class = "xref"> 36. Empilhamento também poderia ser devido a uma interacção proteína-proteína através de uma proteína dentro ou sobre as bicamadas lipídicas (a mancha utilizado não é mencionado) ^37. A formação da pilha de fosfolípidos por PT foi observada desde o início; no entanto, trabalho posterior tem incidido sobre a remoção ou abolir esta formação artefato ^38.

Aqui, propõe-se um método para aproveitar a nanodisc induzida napt empilhamento para o estudo de proteínas de ligação de membrana por TEM. Em suma, obrigatória para as nanodiscs proteína impediria os nanodiscs de empilhamento. Embora as razões para o empilhamento não são claros, foi proposto que ³⁹ existe uma interacção electrostática entre os fosfolípidos e o grupo fosforilo da PT, fazendo com que os discos adiram uns aos outros (Figura 1A). A hipótese atrás nosso protocolo é que quando uma proteína se liga a um nanodisc, a maior parte da superfície de fosfolípido não é disponí ble para a interacção com o PT devido a impedimento estérico da proteína. Isto iria evitar a formação da pilha (Figura 1B). Duas conclusões podem ser tiradas. Em primeiro lugar, a prevenção de empilhamento significa que a proteína de interesse está ligado à membrana. Em segundo lugar, o complexo proteína-ND pode ser tratado com os métodos de processamento de uma única partícula padrão ^{24, 40} para obter uma morfologia grosseira do complexo. Além disso, as análises por métodos tais como a electroforese em gel não desnaturante ou dispersão dinâmica da luz pode ser realizado.

Para demonstrar esta hipótese, utilizou-se a proteína de ligação à membrana de 5-lipoxigenase (5LO), que está envolvida em muitas doenças ^{inflamatórias, 41 42.} Esta proteína de 78 kDa requer iões de cálcio para se ligar à sua membrana ^43. Embora esta associação membrana tem sido estudada extensivamente utilizando lipossomass = "refex"> ^{44, 45, 46} e ⁴⁷ fracções de membrana, estes não podem ser utilizados para a análise TEM e determinação da estrutura.

A preparação de nanodiscs começa por mistura com lípidos MSP ressuspensas no detergente colato de sódio. Após incubação em gelo durante 1 h, o detergente é lentamente removido da mistura reconstituição utilizando uma resina adsorvente. Este tipo de material é frequentemente feito de poliestireno moldado em pequenos grânulos. Eles são relativamente hidrofóbico e têm uma forte preferência para o detergente de ligação em comparação com lipídeos ^48. Depois de remover as pérolas hidrofóbicas e realizando clarificação com centrifugação, os nanodiscs são purificados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os nanodiscs purificadas são misturados com uma proteína de membrana monotópico (e possíveis cofactores) em uma proporção equimolar (ou várias proporções para uma titulação) e são deixados a react (15 min). A análise por TEM é levada a cabo aplicando-ul quantidades de amostra em, grelhas revestidas de carbono têm um brilho descarregada e, em seguida, através da realização de coloração negativa com napt. A mesma amostra de quando as alíquotas foram aplicadas às grades de MET pode ser utilizado para análise por não desnaturante ou SDS-PAGE electroforese em gel, bem como por vários tipos de medições da actividade, sem grandes alterações.