JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Published: February 22, 2017
doi:
10.3791/55146
, , , , ,
1Institute for Lung Research, Universities of Giessen and Marburg Lung Center,Philipps-University Marburg, 2German Center for Lung Research, 3Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine,University Medical Center Giessen and Marburg

Summary

Burada, Legionella pneumophila (L. pneumophila) Sıvı kültürlerden dış zar vezikülleri (OMV'ler) saflaştırılmasını anlatmaktadır. Bu arıtılmış, veziküller daha sonra pro-enflamatuar bir potansiyel analiz etmek için makrofajların tedavisi için kullanılmaktadır.

Abstract

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.

Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Introduction

Bakteriler farklı mekanizmalar 1 vasıtasıyla virülans faktörleri salgılar olabilir. iyi bilinen salgılama sistemleri yanı sıra, Gram-negatif bakteriler bilgi alışverişi ve küçük dış zar vezikülleri (OMV'ler), küremsi veziküller 10-300 nm çapında ve iki katmanlı bir membran yapısı ile ile hastalık oluşturma faktörlerini sağlar. Bunlar büyüme ortamlarında (sıvı kültür, bir katı kültür ve biyofilm) çeşitli ve tüm büyüme aşamalarında 2, 3 salgılanır. OMV'ler önemli bir ulaşım aracı (örneğin, OMV yüzeyinde bulunan proteinler, adhesinler, toksinler ve enzimler gibi LPS için) 4. Intraluminal kargo, proteolitik bozulması korunmuş, bu nedenle uzun mesafelerde hareket edebilir, ve veziküller vücut sıvıları ve uzak organlara 5, 6 bulunabilir olduğu"xref"> 7, 8. Bunlar sadece tanınan ve ökaryotik hücrelerde 9, 10 tarafından içine alınır, ama daha yerleşik hücrelerde 4 bakterilerin ve bunların istila bağlanmasını kolaylaştırmak için mümkün olamaz. Legionella pneumophila (L. pneumophila) OMV'leri serbest bir Gram negatif bir bakteridir. Insan akciğerinde, öncelikle doğal konak tatlısu amipler 11 olmasına rağmen, makrofajların bozar. Bir L. pneumophila enfeksiyonu Lejyoner hastalığı, pnömoni 12 şiddetli bir formu neden olabilir. konakçı hücrede bloke fagosom-lizozom füzyon. Bir çoğaltma niş, Legionella içeren yeni vakuol (LCV), 13, 14 oluşturulduğu sayede Ayrıca, ev sahibi organellerini acemi. Lizozomal bozulması sadece efektör protein tra tarafından engellenirTip IV sekresyon sistemi üzerinden değil, aynı zamanda OMV'lerin 15 salınımı ile nslocation.

bakteriyel kültürlerden OMV'lerin saflaştırma alıcı hücrelere üzerindeki etkisini analiz etmek için gereklidir. L. pneumophila OMV'lerden protein içeriği ve alveol epitel hücrelerinin 16, ancak insan akciğer doku nakilleri ile daha sonraki çalışmalar veziküller etkisi üzerinde duruldu önceki çalışmalarda L. pneumophila OMV'ler alveoler makrofajlar 17 tarafından alınır olduğunu göstermiştir.

OMV'ler, bu patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve diğer bakteriyel antijenler olarak, ökaryotik hücrelerin enfeksiyonu ile ilgili bir etkisi vardır ve konak immün cevabı 18 modüle olabilir. L. pneumophila OMV'ler hızla dahası, onlar membranöz TLR2 19 etkinleştirmek, konak hücre zarları ile sigorta ve. Bu L pneumoph bilinmektedir zamandaIla OMV'ler, bir pro-enflamatuar bir şekilde 16, 17 makrofajlar ve epitelyal hücreleri uyarır, insan ve murin makrofaj enfeksiyon sürecine OMV'lerin etkilerini analiz ettik.

Burada, biz doğrudan veya bir enfeksiyonu takiben, diferansiyel Ultrasantrifügasyon tarafından salgılanan OMV'ler izole etmek ve ökaryotik konak hücreleri üzerinde veziküller etkisini değerlendirmek için sıvı kültüründe L. pneumophila yetiştiriciliği için bir protokol açıklar.

Protocol

1. Orta ve Agar Tabaklar hazırlayın sıvı ortamında (YEB) 1 L hazırlayın. ACES 10 g damıtılmış su, 900 mL maya ekstresi, 10 g çözülür. KOH (5 K) ile 6.9 pH ayarlayın. L-sistein ve Fe, 10 ml (damıtılmış su 10 mL 0.4 g) 10 ml ekle (3) 3 x9H 2 O (damıtılmış su 10 mL, 0.25 g) verdi. damıtılmış su ile 1 L'ye kadar doldurun ve çözelti (gözenek boyutu: 0,22 um) steril filtre. 4 ° C'de saklayın. agar plakaları tamponlu kömür maya özü (BCYE) hazırlayın. ACES 10 g damıtılmış su, 900 mL maya ekstresi, 10 g çözülür. KOH (5 K) ile 6.9 pH ayarlayın. agar 15 g aktif kömür 2.5 g ekleyin. Damıtılmış su ve otoklav ile 1 L'ye kadar doldurun. Ve L-sistein 10 ml ekleyin (10 mL damıtılmış su içinde 0.4 g) Fe (10 mL NO 3) 3 x9H 2 O (damıtılmış su 10 mL, 0.25 g, filtrasyon ile sterilize hem 0.22 um ileSoğutulan BCYE (yaklaşık 50 ° C) gözenekler). 4 ° C'de plakaları ve mağaza dökün. 2. L. pneumophila Yetiştirmek BCYE agar plakaları üzerinde L. pneumophila soyu Corby (vahşi tip, WT) yayılır ve 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübe. Bir OD ön kültür plaka L. pneumophila ile 0.3 600 yeb 10 ml aşılamak; 6 saat için bir döner sallayıcı (150 rpm) 37 ° C'de bakterileri inkübe edin. Bir kan agar plaka üzerinde süspansiyon 100 uL yayarak sıvı kültürü saflığını doğrulayın. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Taze YEB ortamı 90 mL geri kalan sıvı kültürü eklenir ve yaklaşık 16-20 saat sürer OD 3.0-3.5 600 ulaşmak için bir döner sallayıcı (37 ° C ve 150 rpm) üzerinde inkübe edin. 3. hazırlayın ve L. pneumophila OMV'leri niceliğini NOT: Aşağıdaki merkezkaçlama aşamasının hepsinin yürütülebileceğisteril şartlar altında ve 4 ° C 'de s. bakterinin ufalanması için 20 dakika boyunca 4000 x g'de sıvı kültür santrifüjleyin. Taze santrifüj tüplerine süpernatant aktarın bakteriyel pelet atın ve santrifüjleme (20 dakika 4.000 xg) tekrarlayın. kez bu adımı yineleyin. Steril filtre iki kez süpernatant kalan (gözenek boyutu: 0.22 um). 3 saat için 100.000 xg'de ultrasantrifüjdeki tüpleri ve ultrasantrifüjdeki için bakteri ücretsiz süpernatant aktarın. süpernatant süzün ve atın. kirletici proteinler ve LPS kaldırmak için steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ultrasantrifuju (3 saat boyunca 100,000 x g) OMV pelletini. Süpernatantı atın ve steril PBS 500 mcL OMV pelletini. ul kan agar plakası üzerinde ve bir BCYE agar plakası üzerinde Streak 20 Hazırlanan veziküllerin bakteriyel kontaminasyonu dışlamak için. 37 ° C'de 3 gün (her ikisi için bir gecede kan agar plaka ve BCYE ağar plaka inkübe6 ° C). üreticinin talimatlarına göre bir bisinkoninik asit yöntemiyle OMV preparatından elde edilen protein miktarını ölçmek. Not: 100 ml L. pneumophila kültürü konsantrasyonu genellikle 1 ug / ml. -20 ° C'de hazırlandı ve sayısal OMV'ler saklayın. 4. Ön tedavi Makrofajlar THP-1 hücreleri hazırla. Not: THP-1, bir lösemili hastanın türetilmiş bir monositik hücre hattıdır. 24 yuva başına 2×10 5 THP-1 hücreleri ekleyin ve makrofaj benzeri hücrelere 20 nM forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ilave edilerek bunları ayırt. 37 ° C'de 24 saat süreyle inkübe edin. taze ortam 500 uL orta yerine ve bir 24 saat daha inkübe; THP-1 hücreleri için uygun ortam,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş RPMI 1640 yüksek glukoz oluşmaktadır. Bakınız de tarif edildiği gibi, fare kemik iliği türevli makrofajlar (mBMDM) izole20 rüler. OMV'ler ile THP-1-türevi makrofaj veya mBMDM tedavi edin. Aşama 3'te hazırlanan OMV'ler çözülme ve insan ya da kemirgen makrofajlara protein miktarı (0.1, 1 ve 10 ug / mL) göre ekleyin. en az 20 saat boyunca 37 ° C'de OMV'ler içeren makrofajları inkübe edin. ELISA için süpernatant kullanın ya da 5. adımda ile hareket. 5. makrofajlan enfekte ve koloni-oluşturan birim (CFU) testi ile bakteriyel replikasyonu değerlendirilmesi Aşama 2.1 L. pneumophila kullanarak, aşama 4,3, THP-1 hücreleri veya mBMDM önceden muamele edilmiş ve kontrol grubu (2×10 5/24 kuyu) ve makrofajlar önceden tedavi. orta alışverişinde yok. L. pneumophila Corby bir flagellin-eksik mutant L. pneumophila Corby WT ve mBMDM ile THP-1 hücreleri enfekte (her ikisi de bir enfeksiyon çokluğu 0.5 ile (MOI), 1×10 5 L. pneumophila / 24 kuyu) ve 24 boyunca inkübe ve 48 saat sırasıyla. bo hazırlayıninci L. pneumophila Corby (WT veya flagellin-eksik mutant) adım 2.1 'de açıklandığı gibi. Lyse saponin ilave ederek ortam içinde hücreler (nihai konsantrasyon:% 0.1) ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Pipetleme bakterilerin yeniden süspanse edin ve bir reaksiyon kabına süspansiyon aktarın. Steril PBS medya ihtiva-eden L. pneumophila seri dilüsyonları hazırlayın. Şerit BCYE agar plakaları üzerinde gerekli dilüsyonları 50 ul ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe edilir. Görme oluşan kolonileri saymayın. CFU hesaplayın ön işleme tabi ama% 100 ayarlanır makrofajlar, enfekte değil CFU sayısı sonucunu normalleştirmek.

Representative Results

Deney düzeneği L. pneumophila OMV'leri hazırlamak ve Şekil 1'de gösterilmektedir enfeksiyonu sonrası makrofajların pro-enflamatuar yanıtı üzerindeki etkilerini analiz etmek. Hazırlanan OMV'lerin pro-enflamatuar potansiyeli, Şekil 2'de gösterilen PMA diferansiye THP-1 hücreleri üzerinde analiz edilebilir. THP-1 hücreleri, IL-8 ve IL-6 salgısının zaman ve doza bağımlı bir artış ile yanıt verir. Şekil 3'te CXCL1 ELISA tarafından sunulan Ek olarak, L. pneumophila OMV tanıma farklı TLR'lerin etkisi, farklı genetik geçmişleri olan mBMDM kullanılarak analiz edilebilir. OMV uyarıldıktan sonra CXCL1 salgılanan WT farelerden mBMDM iken mBMDM TLR2 / 4 – / – daha az salgılanan. THP-1 makrofaj bakteriyel replikasyon L. pneumophila OMV'lerin etkisini incelemek için hücreler OMV'ler ile önceden inkübe edilir ve daha sonra ilave olarak enfekte edildiL. pneumophila ile (Şekil 4 A). THP-1-kaynaklı makrofaj ön stimülasyonu, ilk enfeksiyonu 24 saat sonra bakteri çoğalmasını azaltır, ancak daha sonraki bir zaman noktasında (48 saat pi) saymak CFU bir iki katına yol açar. Şekil 4, B gösterildiği gibi makrofajların enfeksiyondan sonra OMV tanıma sinyal Toll benzeri reseptör (TLR) etkisi, mBMDM ile değerlendirilebilir. Hücreler L. pneumophila çoğaltma bu artış gösterme – / – – ve TRIF / MyD88 – / TLR2 ise OMV ön inkübasyondan sonra WT hayvanlardan mBMDM on kat bakteriyel replikasyon artar. Şekil 1: Deney prosedürü. (A), L. pneumophila Corby ila 10 cm BCYE agar plakaları taze YEB 90 mL aktarılır küçük sıvı kültür (10 mi), aşılamak için kullanılır arasında6 saat sonra, ortam. Bir küçük hacimli de saflık kontrol etmek için bir kan agar plaka üzerine kaplanır. Bakteriler erken sabit fazda (= 3.0-3.5 OD 600) kadar 37 ° C'de inkübe edilir. (B) sıvı kültür santrifüj lenmiş ve bakteri kaldırmak için steril filtre edildi. Legionella içermeyen yüzer madde daha sonra tekrar santrifüje PBS içinde yeniden süspansiyona alınmış ve bir OMV pelet elde etmek için santrifüje edilir. İzole veziküller saflık açısından kontrol yeniden süspansiyona alınmış, ve protein miktarı için ölçülür. Ölçek çubuğu 2.5 cm temsil eder. (C), insan ya da kemirgen makrofajlar sayısallaştırılmış OMV'ler ile uyarılır. Hücre kültürü süpernatanı, ELISA için kullanılabilir, ya da makrofajlar 10 cm'lik BCYE agar plakaları üzerinde CFU tahlili ile bakteriyel replikasyonu belirlemek için L. pneumophila ile enfekte edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </a> Şekil 2: L. pneumophila OMV'ler ile THP-1 hücrelerinde pro-inflamatuar aktivite. (A) Burada, monositik THP-1 hücre çizgisi alveoler makrofajlar için bir model olarak kullanılır. PMA diferansiye THP-1 hücreleri, sırasıyla, 24 ve 48 saat süre ile, L. pneumophila OMV'ler (0.01-25 ug / ml) artan dozları ile tedavi edilmiştir. Hücre içermeyen yüzer kısım, IL-8 ELISA kullanıldı. ± SEM üç bağımsız deneyin ortalama değerleri gösterilmektedir. THP-1 hücreleri, zaman ve doza bağlı olarak belirgin, IL-8 salgılanması ile olduğu gibi, az 0.01 mg / ml, L. pneumophila OMV'ler yanıt verdi. (B), L. pneumophila OMV'ler (0,1-10 ug / ml), PMA diferansiye THP-1 hücreleri uyarmak için kullanıldı. Süpernatan inkübasyondan 24 ve 48 saat sonra toplandı ve salgılanan IL-6 ELISA ile yüzer ölçülmüştür. ± SEM üç bağımsız deneyin ortalama değerleri gösterilmektedir. Hatta OMV'lerin en düşük dozda (0.1 ug / mL) ile, IL-6, önemli miktarlarda salgılanan THP-1 hücreleri. IL-6 sekresyonu OMV artan dozları ile uzun süreli kuluçkaya bırakma süreleri ile artar. İstatistikler: Mann-Whitney testi; * P <karşılık gelen 0 ug / ml OMV ile karşılaştırıldığında 0.05 ** p <0.01. Referans 20. izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: makrofajların pro-enflamatuar aktivasyonu TLR2 / 4 bağlıdır. WT mBMDM ve TLR2 / 4 – / – fareleri, L. pneumophila OMV'ler (0.1 ya da 1 ug / ml) ile inkübe edilmiştir. CXCL1 salgılanması sırasıyla 24 ve 48 saat sonra ELISA ile analiz edilmiştir.Üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM değerleri gösterilmiştir. WT farelerden mBMDM L. pneumophila OMV inkübasyondan sonra doza bağımlı CXCL1 salgılanması ile cevap verdi. TLR2 / 4 – / – mBMDM WT mBMDM ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az CXCL1 salgılanan ve bu salgılama doza bağlı olarak artış göstermedi. İstatistikler: Mann-Whitney testi; karşılık gelen 0 ug / ml OMV ile karşılaştırıldığında * p <0.05; #p <0.05 eşit muamele WT numune ile karşılaştırıldığında. Referans 20. izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4: makrofajlarda L. pneumophila OMV ön inkübasyon artar bakteri çoğaltma. (A) Farklılaşmış THP-1 hücreleri OMV'ler (0.1, 1 ile önceden inkübe veya 10 μ edildiG / ml) veya LPS / IFN-γ (200 ng / ml her biri) ya da kontrol için tedavi edilmeden bırakıldı. Ön kuluçka (20 saat), THP-1 hücreleri, sırasıyla, 2, 24 ve 48 saat süre ile, L. pneumophila Corby WT (MOI 0.5) ile enfekte edilmiştir. THP-1 hücreleri saponin eklenerek lize edildi ve bakteri BCYE agar plakaları üzerine plakalanmıştır. CFU her zaman noktasından sonra 0 mg / ml OMV'ye göre hesaplanmıştır. çubuk, üç bağımsız deneyin, teknik iki kopya halinde gerçekleştirilmiştir, her biri ortalama ± SEM değerlerini temsil eder. pre-muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında bakteriyel alımı (2H Enfeksiyondan (PI)) 'de herhangi bir fark yoktu. bakteriyel replikasyon değişiklikler, sırasıyla, 24 ve 48 saat sonra tespit edilmiştir. LPS / IFN-γ, önceden muamele edilmiş THP-1 hücreleri Bu, L. pneumophila OMV önceden tedavi edilen hücreler için doza bağlı olarak gözlendi bakteri yükü 24 saat pi bir azalma gösterdi. Sonraki bir zaman noktasında (48 saat PI) 'de OMV ön işlemden THP-1 hücreleri, L. pneumophila re kat olduğunu gösterdiPlikasyon, LPS buna / IFN-γ, önceden muamele edilmiş makrofajlar bakteri yükünün daha da azalma göstermiştir. İstatistikler: Mann-Whitney testi; * P <karşılık gelen 0 ug / ml OMV ile karşılaştırıldığında 0.05 ** p <0.01. 20 saat boyunca 0.1 mg / ml, L. pneumophila OMV'ler ile önceden inkübe edildi ve daha sonra bir flagellin- ile enfekte edilmiştir (B) mBMDM farklı genetik arka planı olan farelerde (WT TLR2 – / – ve TRIF / MyD88 – / -) için 48 saat L. pneumophila Corby (İçişleri 0.5) ve eksikli mutant. mBMDM saponin eklenerek lize edildi ve Legionella BCYE agar plakaları üzerine plakalanmıştır. CFU kesintisiz çizgi ile gösterilen, 0 ug / ml OMV göre hesaplanmıştır. çubuklar ortalama değerleri ±± SEM üç bağımsız deneyler, çiftleri yapılan her temsil etmektedir. WT farelerden mBMDM OMV ön tedaviden sonra L. pneumophila çoğaltma bir artış gösterdi. TLR2 – / – makrofajlar önemli ölçüde azalır gösterdi <emtrif > Legionella çoğaltma, – / – mBMDM. İstatistikler: Mann-Whitney testi; WT örnek ile karşılaştırıldığında p <0.05. Referans 20. izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bakteriyel etkenler ve hedef hücreler üzerinde bu zar veziküllerinin etkisi OMV'ler anda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Örneğin, Clostridium perfringens OMV'ler makrofajlarda sitokin salgılanmasını teşvik -türevli, B lenfositler, Borrelia burgdorferi OMV'ler ile aktive ve Helicobacter pylori membran vezikülleri, mide epitel hücreleri 21, 22, 23 hareket edebilir -released edilebilir. L. pneumophila, atipik pnömoni şiddetli bir formu uyarabilir bir hücre içi patojen, aynı zamanda akciğer epitel hücreleri ve makrofajlar 16, 19 aktive edebiliyoruz OMV'leri serbest bırakır. Burada, pnömoni OMV'lerden potansiyel rolünü incelemek için sıvı kültürden L. pneumophila OMV'lerden küçük ölçekli izolasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut. Steril iklimlendirme altında çalışmak için önemlidiriyonları ve saf L. pneumophila elde etmek için diğer bakterilerden kirlenmeyi ekarte etmek OMV hazırlık -türevlenmiş. OMV'lerin izolasyonu büyük OMV'ler, bu filtre etme adımı ile kaybolur, çünkü bu OMV verimi azaltır bile, L. pneumophila elde OMV pelet kirlenmesini önlemek amacıyla, 0.22 mikron gözenek ile filtrasyon aşamasını kapsar.

Bundan başka, daha yakından OMV'ler hücre dışı bakteriler x 15 LCV salındığının Legionella pnömoni, durumu yaklaştığı yalıtılmış veziküller ve L. pneumophila ile enfekte edilmiş hücrelere insan ve murin makrofaj tepkisini test edilmiştir. Kullanılan OMV doz 24 saat inkübasyondan sonra, insan makrofajları bir in vitro enfeksiyon serbest OMV miktarına göre tahmin edilmiştir (Referans 20 de tarifedilmiş). Diğer alıcı hücrelerin uyarılması için ve in vivo deneyler,Diğer OMV dozlar gerekli olabilir ve oluşturulması gerekir. L. pneumophila OMV'lerin etkisinin analizi, Jager ve Steinert 24 tarafından tarif edilen protokole bir gelişmeyi temsil etmektedir.

Burada, THP-1 hücreleri nedeniyle birincil insan malzemenin sınırlı sayıda alveoler makrofajlar için bir model olarak hizmet PMA-farklılaşmış. PMA ilave makrofaj benzeri hücre 25 içerisine monositik THP-1 hücreleri ayırır. Ayrıca, L. pneumophila için iyi bilinen bir model hücre hattı 26 çalışmalardır. Bu insan monositik hücre hattı yanı sıra, mBMDM hücreleri kullanılır. mBMDM yaygın L. pneumophila 27, 28, 29 etkilerinin incelenmesi için kabul edilir. Farklı TLR'lerin veya diğer proteinler için genetik Knockouts kullanma imkanı onlara OMV etkilerini araştırmak için değerli bir araç yapmak. ordDeneme başına farelerin miktarını düşürmek için er, mBMDM yerine makrofajlar sınırlamaları nedeniyle alveoler makrofajların kullanılır. Anahtar deneyler doğrulama için makrofajların gerektirebilir.

Ultrasantrifüj arasında tarifnamede tarif edilen protokol OMV'leri saflaştırmak için Bunun yanı sıra, Chutkan ark protokolüne dahil olan bir yoğunluk gradyan santrifüjleme, gerçekleştirmek mümkündür. 30. Bu elde edilen OMV hazırlık saflığını iyileştirmek ve ortak saflaştırılmış protein agrega, flagellin ve LPS miktarını azaltabilir. Elde edilen OMV preparatın saflığı transmisyon elektron mikroskobu ya da kalite kontrol ek bir adım olarak nanopartikül izleme analizi ile analiz edilebilir. Bu Burada sunulan protein ölçüm prosedürü ötesinde, miktarının ek bir araç sağlayabilir. İsteğe bağlı olarak, LPS konsantrasyonu Limulus amebocyte lizat testi ile analiz edilebilir. OMV verimi düşük ise, birsantrifüj filtre üzerinden ek konsantrasyon adımı burada bitmiş değil, hangi yapılabildi. verim beklenenden düşük ise, OMV'ler atıldı.

OMV'lerden arkasındaki biyolojik mekanizmaları ve işlevleri aydınlatmak için çabalarımızın bir parçası olarak, OMV üretimi üzerine farklı stres koşullarının etkisi test edilebilir. Besin yoksunluk, zararlı maddelere inkübasyon sıcaklığı, ya da maruz değişiklikler OMV salgısı 31 üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Olası stres koşulları Klimentova ve Stulik 32 protokol tartışılmıştır. Ayrıca, hiper veya hypovesiculating L. pneumophila mutantlar oluşturulabilir. Farklı OMV preparasyonlar daha sonra, (Referans 17'de tarif edilmiştir), insan akciğer dokusu, eksplantlar ya da in vivo modellerde makrofajlar enfeksiyonu deneylerde analiz edilebilir. Bakteriyel iletişimde onların etkisi doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyon OMV'lerden rolü yanındadeneysel ele alınabilir. Bundan başka, çeşitli doğal bağışıklık sinyal kaskadlar etkisi murin nakavt hücreler kullanılarak ya da insan hücre çizgilerinde CRISPR / Cas9 tırnakları üretilmesi ile analiz edilebilir. OMV'lerden Bu temel araştırma zaten Neisseria meningitidis 33 tarafından iletilen menenjit B ana kadar yeni aşı stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

OMV izolasyonu ve karakterizasyonu protokol başlayarak bir başka Gram-negatif bakteri ve diğer konakçı hücreleri, bu uygulayabilir; sadece, sıvı kültür içinde bakterilerin büyümesine ayarlanması gerekmektedir. Chutkan et at tarafından yayınlanmıştır protokol. Escherichia coli ve Pseudomonas aeruginosa 30 OMV'lerden nesil hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Kültür lize bakterilerde artışları ve kirletici proteinler ve mem önlemek için geç bir sabit faz ulaşmamalıdırbrane'ler. Buna ek olarak, konakçı hücrelerin uyarılması için kullanılan OMV doz hala sitotoksisite oranı düşük sağlarken, in vivo enfeksiyon sırasında OMV'ler miktarına göre tespit edilmesi gerekmektedir. Bu şekilde, OMV'lerin patolojik bir rolü, türler arası iletişim, konukçu-patojen etkileşimlerine etkileri incelenebilir.

Ayrıca pnömoni L. pneumophila OMV'lerden rolünü araştırmak için, yeterli verim ve karşılaştırılabilir enfeksiyon deneyleri ile standardize OMV hazırlıkları gereklidir. Bu protokol, izolasyon prosedürleri standartlaştırmak ve diğer Gram-negatif bakterilere karşı ve diğer konakçı hücrelerde OMV çalışmaları uzatmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, araştırma in vivo ayarlara deneyler genişletmek için kullanılabilecek in vitro bilgi, ayrıntılı yararlanacaktır. Gelecekte, bu protokol, serum veya bronkoalveoler Lav primer biyolojik maddeden OMV'lerin, izolasyonu için uzun olabiliryaş sıvı, fizyolojik koşullar altında yayınlanan OMV'lerden bileşimi hakkında fikir edinmek için. Bu OMV kompozisyonun kilit parametrelerini belirlemek ve in vitro -generated OMV'lerden özelliklerini anlamanıza yardımcı olacaktır.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz TLR2 bize sağlamak için Dr. Markus Schnare teşekkür – / – ve TLR2 / 4 – / – fareler ve TRIF / MyD88 Prof. Dr. Carsten Kirschning – / – fareler. Bu çalışmanın parçaları Bundesministerium für Bildung und Forschung tarafından finanse edildi (e: biyo miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) ve Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Tıbbi RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), tüm BS.

Materials

10 cm petridish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5 % sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby — — kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA — — kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM — — kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. , (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12 (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11 (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. . Novartis.com Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016)

Tags

Legionella PneumophilaOuter Membrane Vesicles (OMVs)MacrophagesPro-inflammatory PotentialIsolationPurificationStandardized ProtocolHost-pathogen Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image