Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

1. Aislamiento de células individuales Preparar el microaspirator Retire el extremo de plástico transparente del conjunto del tubo aspirador e inserte el extremo más estrecho en un extremo de un tubo de PVC de 1 pie de largo con 3/16 "de diámetro interior. Insertar la salida de un filtro de jeringa de 0,2 micras en el otro extremo del tubo de PVC 1 pie de largo con 3/6 "de diámetro interior. Inserte la entrada del filtro de jeringa de 0,2 micras en un extremo de un tubo de PVC de 6 pulgadas de largo con 5/16 "de diámetro interior. Opcional: Corte el tubo de PVC de 6 pulgadas de largo con 5/16 "de diámetro interno por la mitad e insertar un separador de agua en línea entre las dos mitades. Romper una pipeta serológica de 5 ml de plástico en la graduación de 1 ml e inserte el extremo roto en el extremo abierto del tubo de PVC con 5/16 "de diámetro interior. Insertar la salida de la pipeta serológica 5 ml de plástico en el extremo flexible de un conjunto de tubo de aspirador (donde el extremo de plástico transparentehabía sido eliminado). Para el almacenamiento, cubrir la boquilla rojo del conjunto del tubo aspirador con un tubo de plástico estéril. Es necesario realizar un tubo capilar de vidrio de un diámetro interior de 10 a 30 micras por lo que el centro del tubo cerca de una llama del quemador Bunsen y la aplicación de la tensión en cualquiera de los extremos del tubo. Romper el tubo estirado en el medio para crear dos agujas potenciales aspirador. Repita este paso con varios tubos, ya que sólo algunos tubos va a terminar con un diámetro interior que es apropiado para recoger células individuales. Para el almacenamiento, colocar dos tiras de plastilina en una placa de Petri de 15 cm y asegurar las agujas del aspirador a través de las tiras. recoger células Preparar una suspensión de células individuales según sea apropiado para el tipo de célula y el experimento. Por ejemplo, para preparar las células adherentes tales como líneas celulares de fibroblastos humanos, células de la cosecha de células tripsinización y transferir a un tubo cónico que contenía medio de comunicación adecuado. Antes, durante, o unaespués de la preparación de la suspensión de células individuales (dependiendo de cuánto tiempo se tarda en preparar la suspensión de una sola célula), la instalación de la campana para la amplificación del genoma completo. Rocíe la superficie de la campana, cajas de puntas de pipeta y puntas de pipeta con un 10% de lejía y limpiar con una toalla de papel. Repita este paso con un 70% de etanol. Añadir 8 l de agua desde el kit de amplificación de todo el genoma (WGA) a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos PCR, un pocillo para cada celda a ser secuenciado. Cubrir la placa de 96 pocillos PCR con una tapa de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y el lugar en el hielo. Añadir 1.000 células a 10 ml de medio o solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de 15 cm Petri y colocar el plato en hielo para evitar que las células se adhieran al plato. Llevar las células en la placa de Petri y el pozo 96 de la placa de PCR con la tapa en hielo a un microscopio de luz con objetivo de 10X. Aumentar la apertura de la aguja de aspiración golpeando suavemente el extremo sacado de THe aguja de aspiración en una superficie dura tal que la punta se rompe. Inserte el extremo ancho de la aguja de aspiración en el extremo alejado de la microaspirator. Coloque la placa de Petri que contiene las células en la platina del microscopio. Coloque la boquilla del aspirador rojo en la boca. Utilice una mano para mover la aguja de aspiración y la otra mano para mover la placa de Petri que contiene las células. Identificar las células individuales a ser secuenciado. El uso de succión boca, dibujar una sola célula en la aguja de aspiración junto con ~ 1-2 l de los medios de comunicación o PBS. La transferencia de la célula en los 8 l de agua dentro de un solo pocillo de la placa de 96 pocillos PCR. Evitar la introducción de burbujas cuando se transfiere la célula. Repita el paso 1.2.7 hasta que se haya aislado el número deseado de células. Mantener la reacción PCR en hielo y cubierto con la tapa entre las células de la cosecha. Marcar los pozos que han recibido células. Al recoger células individuales, descongelar la única 10X tampón de lisis celular y la fragmentación de todo el gkit de amplificación enome. Después de recoger el número deseado de células, proceder inmediatamente a la amplificación del genoma completo. 2. Toda la amplificación del genoma Para evitar la contaminación durante la amplificación del genoma completo, añadir todos los reactivos dentro de una campana de cultivo de tejidos, utilizar puntas de pipeta con filtros y cambiar la punta de la pipeta en el medio pozos. Preparar una solución de lisis y la fragmentación de memoria temporal de trabajo desde el kit de amplificación de todo el genoma (WGA). Para cada conjunto de hasta 32 células, se combinan 32 l de 10x lisis de células individuales y el tampón de fragmentación y 2 l de solución de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga. Vortex el tubo para mezclar las soluciones. Añadir 1 l de tampón de lisis y solución fragmentación de trabajo a cada pocillo y la pipeta hacia arriba y abajo para mezclar. Cubrir la placa y sellar todos los pocillos con una película de plástico. Centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. ciclo térmico como follOWS: 50 ° C, 1 h y 99 ° C, 4 min. Se enfría la placa sobre hielo y centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. Preparar una solución tampón de preparación de biblioteca de trabajo de todo el kit de amplificación del genoma. Para cada celda, se combinan 2 l de tampón de preparación de la biblioteca de células individuales 1x y 1 l de solución de estabilización biblioteca en un tubo de microcentrífuga. Preparar la solución de trabajo por varias células en el mismo tubo de microcentrífuga. Retire la película de plástico y añadir 3 l de solución de trabajo de tampón de preparación de la biblioteca a cada pocillo. Pipetear los contenidos del bien arriba y abajo para mezclar. Vuelva a colocar la lámina de plástico. NOTA: La película de plástico puede ser reutilizado durante todo el proceso de amplificación del genoma hasta que los pozos empiezan a perforaciones en la película. Cuando esto ocurre, cambie a una nueva película de plástico. Centrifugar brevemente la placa en un mini spinner placa y se incuba a 95 ° C durante 2 min. Se enfría la placa sobre hielo y brevementecentrifugar la placa en una mini placa de ruleta. Retire la película de plástico, añadir 1 l de enzima preparación biblioteca a cada pocillo, y la pipeta el contenido del bien arriba y abajo para mezclar. Mantenga la enzima preparación biblioteca en hielo o en un bloque frío a través de este paso. Vuelva a colocar la lámina de plástico. Centrifugar brevemente la placa en mini spinner placa y el ciclo térmico de la siguiente manera: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, y mantener a 4 ° C. Se enfría la placa sobre hielo y centrifugar brevemente la placa en una mini placa de ruleta. Preparar una mezcla de amplificación de trabajo de todo el kit de amplificación del genoma. Para cada celda, se combinan 48,5 l de agua, 7,5 l 10x amplificación de mezcla maestra y 5 l de ADN polimerasa WGA en un tubo de microcentrífuga. Preparar la mezcla de trabajo para varias células en el mismo tubo de microcentrífuga. Mantener la mezcla de trabajo en el hielo. Retire la película de plástico, añadir 61 l de trabajo mezcla de amplificaciónA cada pocillo, y contenido de la pipeta de bien arriba y abajo para mezclar. Mantener la mezcla de amplificación de trabajo en hielo o en un bloque frío a través de este paso. Vuelva a colocar la lámina de plástico. Centrifugar brevemente la placa en un mini spinner placa y el ciclo térmico de la siguiente manera: 95 ° C, 3 min, 25 ciclos de 94 ° C, 30 seg y 65 ° C, 5 min, y mantener a 4 ° C. Transferencia de 60 l de cada muestra a un tubo de microcentrífuga separado y se almacena a – 20 ° C para su uso en el paso 3. Añadir colorante de carga de ADN para el volumen restante de cada muestra (es decir, 3 l de ADN 6x carga de colorante a 15 l de muestra) y ejecute 5 l de cada reacción en un gel de agarosa al 1%. NOTA: Las células que amplifican con éxito aparecerá como una mancha de 250 a 1000 pares de bases. Las muestras que no muestran una mancha, o sólo muestran una débil citología es poco probable que produzca datos de secuenciación útiles. 3. Secuenciación Purificar las muestras con perlas paramagnéticas. ThaLas muestras de ADN w en hielo. perlas paramagnéticas Vortex hasta que la solución es homogénea e incubar las perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Transferir 20 l de cada muestra de ADN en un tubo de microcentrífuga limpio. El resto de la muestra se puede almacenar a -20 ° C. Añadir 30 l (1,5x) de perlas paramagnéticas a cada muestra de ADN y agitar para mezclar. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Deje la solución madre de perlas a temperatura ambiente para su uso en el paso 3.4. Colocar los tubos en una tira tubo magnético durante 2 minutos, o hasta que los granos forman un sedimento y el sobrenadante es claro. Con una pipeta P200, eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible sin molestar a los granos. Añadir 180 l de etanol al 80% a la mezcla de DNA-perla. Girar los tubos varias veces en relación con el imán para "aclarado" las perlas a través de la solución de etanol. Con una pipeta P200, eliminar la mayor cantidad de etanol como el lavado posible sin perturbar las perlas. Repita 3.1.6 y 3.1.7. Secar las cuentas por aproximadamente 10 minutos o hasta que ya no es visible etanol. Proceder al siguiente paso, cuando los granos aparecen grietas o caerse de la pared del tubo. Retire las muestras de la banda magnética. Añadir 40 l de 10 mM Tris pH 8.0 para eluir el ADN de las perlas y agitar las muestras para resuspender las perlas. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente las muestras para recoger el líquido en la parte inferior del tubo y se colocan los tubos en una tira magnética tubo durante al menos dos minutos. Transferir el eluyente en tubos de microcentrífuga limpios y sin molestar a los granos. la normalización de la muestra Cuantificar la concentración de cada muestra usando un espectrofotómetro. Las concentraciones deben variar de 10 a 30 ng / mL. Diluir cada muestra a 0,2 ng / l usando 10 mM Tris pH 8,0. Los siguientes pasos requerirán un mínimo de iNput de 5 l de esta dilución. la preparación de la biblioteca Preparar las bibliotecas de secuenciación siguiendo las instrucciones del kit de preparación de la biblioteca 13. la limpieza final Limpiar las muestras de acuerdo con la etapa 3.1. Para longitudes de lectura de 50 pb, 75 pb o 150 pb, utilizar una proporción de grano para degustar volumen de 1.5x, 1x, o 0,6x, respectivamente. Eluir con 15 l de 10 mM Tris pH 8,0. Ejecutar las muestras en un analizador de fragmentos para comprobar la distribución del tamaño de la biblioteca 14. La distribución del tamaño debe extenderse uniformemente desde 150 a la 900 pb. Cuantificar las muestras mediante qPCR El uso de un kit de cuantificación de la biblioteca, configure una reacción de PCR cuantitativa de acuerdo a las instrucciones del juego 15. Dejar un espacio en blanco la columna añadir las normas positivas (patrones de ADN del kit) y las normas negativo (agua u otra solución en blanco). ciclo térmico como folmínimos: 95 ° C, 5 min (velocidad de rampa de 4,8 ° C / s) y 35 ciclos de 95 ° C, 30 seg (velocidad de rampa de 4,8 ° C / s) y 60 ° C, 45 seg (velocidad de rampa de 2,5 ° C / seg). pooling Determinar cómo se necesitan muchos carriles en la celda de flujo y se dividen las muestras en grupos, con un grupo por cada carril. Para cada grupo de muestras, elegir la muestra con la concentración más baja sobre la base de los datos de qPCR de la etapa 3.5.2 y normalizar todas las muestras en ese grupo a que la concentración de uso de 10 mM Tris pH 8,0. Reunir las muestras en cada grupo. secuenciación Piscinas de carga en la máquina de secuenciación de próxima generación siguientes procedimientos estándar 16. Análisis 4. Datos NOTA: Se requiere un entorno basado en Unix para ejecutar los programas y scripts en esta sección. Instalar el software que se menciona en el protocolo después de su en guías de instala-. Todos los guiones se pueden encontrar en https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/. Recortar las lecturas de 40-nt usando fastx_trimmer partir de la versión 0.0.13 FASTX-Toolkit 17. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l -o 40 example.trim.fastq Alinear las lecturas con el genoma apropiado de referencia (mm.9 para el ratón, hg19 para el ser humano) usando BWA versión 0.6.1 con las opciones predeterminadas 18. BWA ALN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai BWA Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Retire las alineaciones de chrm y los cromosomas al azar, a continuación, ordenar e indexar el archivo resultante utilizando BAM SAMTools versión 0.1.19 19. grep -v -w chrm example.sam | grep -v al azar> example.filtered.sam samtools ver example.filtered.sam -uSh | samtools tipo – example.filtered samtools índice example.filtered.bam HMMcopy funcionar para detectar CNV= "Xref"> 20 Utilice gcCounter en HMMcopy para generar un archivo de referencia GC porcentaje del genoma. Utilice la opción "-w 500000" para especificar el tamaño de la ventana. Utilizar la misma versión del archivo de referencia fasta utilizado en el paso 4.2, pero asegúrese de chrm y los cromosomas al azar se eliminan del archivo FASTA. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig Utilice generateMap.pl en HMMcopy para generar un archivo de maniobra para mapeabilidad. Utilice la opción "-w 40" para especificar leer longitud. Utilizar el mismo archivo de referencia fasta utilizado en el paso 4.4.1. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i -o mm9.fa mm9.fa mm9.bigwig Utilice mapCounter en HMMcopy para generar un archivo de referencia mapeabilidad para el genoma. Utilice la opción "-w 500000" para especificar el tamaño de la ventana. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Utilice readCounter en HMMcopy para generar un archivo de maniobra para cada archivo de BAM. readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig </li> Modificar las rutas de acceso a los archivos de referencia en los guiones (R run_hmmcopy.mm9.r o run_hmmcopy.hg19.r), utilizar los archivos generados anteriormente en el apartado 4.4.1 (por ejemplo, mm9_gc.wig) y 4.4.3 (por ejemplo, mm9_map. peluca) para el GFile las variables y MFILE, que se refieren al archivo de archivo de referencia GC porcentaje y referencia mapeabilidad, respectivamente. A continuación, ejecute la secuencia de comandos proporcionada R "run_hmmcopy.mm9.r" o "run_hmmcopy.hg19.r". R CMD run_hmmcopy.mm9.r LOTE o R CMD run_hmmcopy.hg19.r LOTE Para el procesamiento por lotes de un conjunto de archivos BAM, BAM poner los archivos en una sola carpeta y ejecutar el guión previsto "HMMpipe.pl" en el paquete para llamar segmentos y calcular las puntuaciones de variabilidad (VS). Siga el formato: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm.9 DNAcopy funcionar para detectar CNV 21. Utilice SAMtools versión 0.1.19 para extraer asignada de forma única lee de cada archivo de BAM. samtools ver -h 0 -Fexample.filtered.bam x0004 | egrep -i "@ ^ | XT: A: T" | samtools ver -shū -> example.mapped.bam Utilice MarkDuplicates en Picard versión 1.94 para marcar los duplicados de PCR en el archivo de BAM 22. java-jar MarkDuplicates.jar ENTRADA SALIDA = example.mapped.bam = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true Utilice coveragebed en bedtools versión 2.17.0 para contar mapeado lee en cada una de las ventanas dinámica 500kb mapeables predefinidos en el archivo de cama siempre "mm9.500k.dynamic.win.bed" o "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed Conteos | Ordenar -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts Utilizar el script Perl proporcionado "normalizeGC.pl" para normalizar los recuentos de lectura basado en el archivo de referencia proporcionado contenido de GC "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" o "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ". Perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts Utilice la secuencia de comandos R "dnacopy.r" proporcionado para llamar a los segmentos. R CMD dnacopy.r LOTE identificar las VNC Excluir las células para las que el VS calculada en 4.4.6 es superior a 0,26. Filtrar los segmentos llamados por HMMcopy en 4.4.6 para incluir sólo aquellos para los que la ratio de la mediana de registro 2 es mayor que 0,4 (ganancia putativo) o menos de -0.35 (pérdida putativo). Filtrar los segmentos llamados por DNAcopy en 4.5.5 para incluir sólo aquellos para los que significa el segmento es mayor que 1,32 o menos de 0,6. La superposición de los segmentos de 4.6.2 y 4.6.3, llamando CNV sólo en las regiones donde tanto HMMcopy y DNAcopy identifican una ganancia o pérdida putativo putativo.