Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos
Summary
Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.
Abstract
morfogénese tubária é um requisito fundamental para o desenvolvimento da maioria dos órgãos de mamíferos, incluindo o sistema reprodutivo masculino. O epidídimo, parte integrante do sistema reprodutor masculino, é responsável pela estocagem de esperma, maturação e transporte. O epidídimo adulto é um tubo altamente enrolada que se desenvolve a partir de um precursor embrionária simples e direto conhecido como duto de Wolff (WD). enrolamento adequada do epidídimo é essencial para a fertilidade masculina, como o esperma no testículo são incapazes de fertilizar um óvulo. No entanto, o mecanismo responsável pelo desenvolvimento e epididimal de enrolamento permanece pouco clara, parcialmente devido à falta de métodos de cultura de órgãos e de imagem inteiros. Neste estudo, descrevemos um sistema de cultura in vitro e todo o protocolo de imunofluorescência de montagem para visualizar melhor o processo de enrolamento de WD e desenvolvimento, o que pode também ser aplicada ao estudo de outros órgãos tubulares.
Introduction
O sistema reprodutor masculino é composto principalmente de testículo, o local para o desenvolvimento de células germinativas e diferenciação, e um sistema ductal complexo que é necessário para a maturação, de transporte, de armazenamento e de esperma. Epidídimo é um órgão tubular que liga testículo com vasos deferentes e, principalmente, envolvidos no desenvolvimento pós-testicular e maturação das células germinativas 1. O epidídimo altamente enrolados do rato adulto desenvolve a partir de um tubo simples e direto precursor, duto de Wolff (WD) 1. A estrutura complexa e enrolada de epidídimo é essencial para o esperma para adquirir a capacidade de fertilizar células germinativas femininas 2. Como tal órgão essencial para a fertilidade masculina e desenvolve fica em forma não é bem compreendido. Várias vias de sinalização foram mostradas para ser envolvido no desenvolvimento de WD, tais como a via de sinalização Wnt 3,4 e o androgénio via da 5 sinalização. Nosso trabalho recente estabeleceu a exigência de balANCED Wnt sinalização para WD enrolamento durante o desenvolvimento pré-natal 4. No entanto, mais estudos são necessários para entender os mecanismos envolvidos no enrolamento pós-natal do epidídimo, diferenciação celular, e comunicação célula-célula dentro do epitélio do epidídimo e com células intersticiais.
Modelos de ratos geneticamente modificados têm sido provado ser uma poderosa ferramenta para a identificação / validação dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e doenças de diversos sistemas de órgãos 6. Apesar de sua ampla utilização, existem limitações significativas de modelos de ratos geneticamente modificados, incluindo o fenótipo imprevisíveis de ratos mutantes alvo com relação à função do gene presumido, e nenhum fenótipo em mutantes nulos em alguns modelos, a influência de fatores genéticos e ambientais, trabalho intensivo e demorado processo de desenvolvimento de modelos de ratinho. Portanto, a interpretação do significado dos resultados apenas dos geneticamente modimodelos ficados rato nem sempre é simples 6. Estas limitações podem ser superadas utilizando em sistema de cultura de órgãos in vitro que nos dá a flexibilidade de manipular múltiplas vias de sinalização em tempo real, em condições de cultura controladas. Sistema de cultura de órgãos é fundamental para a compreensão da fisiologia e patologia dos órgãos inteiros 7. Além disso, a imagiologia de órgãos inteiros coradas com anticorpos etiquetados fluoróforo nos permite visualizar os marcadores de interesse num contexto tridimensional, tal como existe in vivo, proporcionando assim uma melhor compreensão da forma do órgão, estrutura, função e 8.
Aqui, descrevemos os métodos para isolamento de rato cumes gonadal embrionárias, a cultura in vitro e toda imagem imunofluorescência monte da WDS, que podem ser aplicados para responder a uma variedade de questões relativas à morfogênese de órgãos tubulares, tais como WDS. Neste protocolo,isolado de rato embrionário pregas genitais de 15,5 dias post coitum (DPC) vacas prenhes e cultivaram-durante 3 d seguido de imunocoloração para um marcador das células epiteliais (citoqueratina 8, CK8), um marcador de proliferação celular (fosfo-Histona 3, PH3) e activa βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema de cultura de órgãos tem muitas vantagens sobre o sistema de cultura celular tradicional. Este sistema retém as relações estruturais originais e as interacções entre diferentes tipos de células. Ele imita em sistemas in vivo e dá informações mais precisas do que os estudos de cultura de células, onde o fator de nicho está ausente. A utilização de sistemas de cultura de órgãos mesmo tem vantagens sobre o uso de todo o animal. Estes incluem o custo mais elevado de utilização …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo de oncologia ginecológica para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é em parte suportado pelo financiamento do National Health and Medical Research Council, o Conselho Australiano de Pesquisas, eo Cancer Institute NSW (PST). MK é um receptor da Universidade de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
Referenzen
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- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
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