وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em> ذبابة الفاكهة</em> أدمغة
Summary
ذبابة الفاكهة الدماغ الكبار هو نظام القيم لدراسة الدوائر العصبية، وظائف الدماغ العليا، واضطرابات معقدة. وسيلة فعالة لتشريح أنسجة المخ كله من الرأس ذبابة صغيرة وتسهيل الدراسات القائمة على الدماغ. نحن هنا وصف، بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة من أدمغة البالغين مع التشكل الحفاظ عليها جيدا.
Abstract
هناك اهتمام متزايد في استخدام ذبابة الفاكهة لنموذج الدماغ من الأمراض التنكسية الإنسان، خريطة circuitries العصبية في أدمغة البالغين، ودراسة الأسس الجزيئية والخلوية من وظائف المخ العليا. وإعداد كامل جبل أدمغة البالغين مع التشكل المحفوظة جيدا أمر بالغ الأهمية لمثل هذه الدراسات القائمة على الدماغ كله، ولكن يمكن أن يكون تحديا وتستغرق وقتا طويلا من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول نهج تشريح خطوة واحدة سهلة لتعلم، من رأس الذبابة في أقل من 10 ثانية، مع الحفاظ على الدماغ سليمة تعلق على بقية الجسم لتسهيل خطوات المعالجة اللاحقة. الإجراء يساعد على إزالة معظم أنسجة العين والقصبة الهوائية التي ترتبط عادة مع الدماغ التي يمكن أن تتداخل مع خطوة التصوير في وقت لاحق، ويضع أيضا أقل من الطلب على نوعية ملقط تشريح. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة بسيطة التي تسمح التقليب مريحة للعينات الدماغ التي شنت على ساترة، وهو أمر مهم لتصوير جانبي بالأمطار مع كثافة إشارة مماثلة والجودة. وكمثال على ذلك البروتوكول، نقدم تحليلا لالدوبامين (DA) الخلايا العصبية في أدمغة البالغين من WT (ث 1118) الذباب. فعالية عالية في طريقة تشريح يجعلها مفيدة بشكل خاص للدراسات تستند الدماغ الكبار على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة.
Introduction
الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة، والمعروف باسم ذبابة الفاكهة، منذ فترة طويلة قيمتها لأدوات الوراثية الأنيقة، وأحيانا الإنجابية قصيرة، وحفظها للغاية المسارات الجزيئية والخلوية. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة بنجاح لتشريح مسارات أساسية الإشارات، وآليات الزخرفة من الكائنات متعددة الخلايا، وكذلك الآليات الكامنة وراء تطوير الخلايا العصبية، وظائف، وأمراض 1،2. مع التطورات الحديثة في تقنيات وضع العلامات الخلية والتصوير، وأصبح الدماغ ذبابة الفاكهة قوية خاصة في رسم الخرائط على ما يرام من الدوائر العصبية وفي تشريح الأساس الجزيئي والخلوي وظائف الدماغ العليا، مثل التعلم والذاكرة، وإيقاع الساعة البيولوجية 1،3، 4،5،6،7،8.
ميزة واحدة معينة من نظام ذبابة الفاكهة هو حجمها الصغير نسبيا، مما يسمح كله جبل إعداد وفحص الدماغ باستخدام مركب العادية أو المجهر متحد البؤر. ثيتمكن الصورة ميزة تحليلات مفصلة التشريحية والوظيفية للدوائر العصبية، أو حتى الخلايا العصبية واحدة، عند مستويات الخلوية والتحت خلوية، في سياق أنسجة المخ بأكملها، وبالتالي تقديم كل نظرة شمولية لدرس الموضوع وهندسته بدقة داخل كله الدماغ. ومع ذلك، وبالنظر إلى حجم مصغر بدلا من الدماغ، ويعرض أيضا تحديا تقنيا في تشريح بكفاءة على أنسجة المخ سليمة من اقية حالة رئيس الهيكل الخارجي في ذبابة الكبار. وقد وصفت مختلف وسائل فعالة وبسيطة نسبيا تشريح في التفاصيل، التي عادة ما تنطوي على الحذر وخطوة حكيمة شطب القضية الرأس والأنسجة المرتبطة بما في ذلك العينين والقصبة الهوائية، والدهون من الدماغ السليم 9 و 10. هذه الأساليب تشريح المجهرية في كثير من الأحيان تفرض ضغوطا صارمة بدلا من ذلك على نوعية ملقط تشريح، والاعتماد على ملقط مع غرامة نصائح متماشية بشكل جيد يمكن أن تتلف بسهولة. وعلاوة على ذلك، كما أدمغة تشريح غالبا ما تكون separatإد من بقية الجسم، والعقل يمكن أن تضيع بسهولة خلال عمليات تلطيخ والغسيل لاحقة بسبب أحجامها الصغيرة وشفافيتها في المخزن المؤقت المعالجة. هنا، نحن تصف بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة نسبيا وسهلة لتعلم، لأدمغة البالغين التي تحافظ على العقول تشريح تعلق على الجذع. عملية تشريح في كثير من الأحيان مسح بسهولة بعيدا معظم الأنسجة المرتبطة الدماغ مثل العين والقصبة الهوائية ويقلل من الطلب على ملقط تشريح ذات نوعية جيدة.
بالإضافة إلى ذلك، عندما تصوير الدماغ تحت المجهر المركب الفلورسنت أو المجهر متحد البؤر، إلى جانب الدماغ الذي هو بعيدا عن مصدر ضوء الفلورسنت غالبا ما تنتج إشارة أضعف والصور أقل وضوحا بسبب سماكة الدماغ كله جبل. هنا، ونحن أيضا تصف طريقة تركيب بسيط يسمح التقليب السهل من العينات الدماغ، مما يتيح سهولة التصوير من كلا الجانبين من المخ مع intensi إشارة مماثلةتاي والجودة.
ونتيجة لإثبات صحة مفهوم لتطبيق هذا الأسلوب لدراسة الدماغ الكبار، درسنا كذلك وجود الخلايا العصبية DA في أدمغة ث 1118 الذباب. النمط الجيني التي كثيرا ما تستخدم كخط الوالدين لتوليد الذباب المعدلة وراثيا والسيطرة wildtype في العديد من الدراسات ذبابة الفاكهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع اهتمام متزايد في استخدام الكبار ذبابة الفاكهة الدماغ لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان الدماغ، الدوائر العصبية، وظائف المخ العليا، فمن الضروري لتطوير أساليب بسيطة وسريعة للحصول على العقول ذبابة سليمة لتحليل كامل جبل، وهو أمر مهم خصوصا للواسع حجم شاشات القا?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف السيد أنيس محمد، السيدة كيارا اندرادي، السيدة بيلار رودريجيز، كريس كوك، والسيدة دانا سورة غافر للحصول على الدعم الهائل لهذا المشروع.
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
Referenzen
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetik. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
