カエルの神経筋終末へのカルシウム色素の神経切片への積載：カエル神経筋接合部におけるカルシウムの一時的な位置合わせ

実験は、 Rana ridibundaカエルの筋肉皮膚の孤立した神経筋調製物で行った。両方の性別の動物のサイズは約5-9cmであった。実験手順は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従って、カザン連邦大学およびカザン医科大学の実験動物の使用に関するガイドラインに従って実施した。この実験プロトコルは、欧州共同体理事会指令86/609 / EECの要件を満たし、カザン医科大学の倫理委員会によって承認された。 1.ソリューションの準備 リンガー溶液の調製。 リンゲル溶液：113.0mM NaCl、2.5mM KCl、3.0mM NaHCO 3 、および1.8mM CaCl 2を調製する。 pHを7.2-7.4に調整する。 低いCa 2+を含むリンゲル溶液を調製する。 </高Mg 2+含量：113.0mM NaCl、2.5mM KCl、3.0mM NaHCO 3、6.0mM MgCl 2、0.9mM CaCl 2 。 pHを7.2-7.4に調整する。 色素装填溶液の調製。 HEPES-Naを含む水系溶液を10 mM（pH 7.2-7.4）で調製する。 14μLのHEPES溶液を染料30と共にバイアルに加える。 注：Ca 2+インジケーター色素は、500μLのバイアルに500μgの粉末を入れたものです。 ボルテックスしてスピンダウンして完全に混合します。 溶液を希釈して、Ca 2+指示薬の最終濃度を30mMに下げる。 -20℃で光および貯蔵に暴露されないようにする。 2.染料充填手順 皮膚の胸筋を胸腹の神経片で解剖する 。 注：解剖の手順は利用可能ですBlioch らによる論文の無償ダウンロード、1968 31 。 解剖の手順には、2つの細かい鉗子と角膜のはさみを使用します（ 表の表を参照）。解剖した組織を、リンゲル溶液で予め充填したシリコンエラストマーでコートしたペトリ皿に移し、細いステンレススチール製のピンで組織を固定し、それを皿の中にわずかに引き伸ばす。 ペトリ皿にリンゲル溶液の新しいアリコートを再充填する。結合組織を除去する。神経を損傷しないでください。 充填ピペットを準備する：かみそりの刃を使用して、標準プラスチック10μLピペットチップの円錐部分の〜2mmの長さの部分を切り取ってください。 ペトリ皿に充填ピペットをマウントするための粘土模型を準備します。 ピペットチップから作られたシリコンチューブとプラスチック接続アダプターを介して充填ピペットの背面をプラスチックシリンジに接続します。 前にdあなたのローディング手順は、プラスチックピペットを使用して、ペトリ皿からリンガーのソリューションを削除します。微細な注射器を用いて筋肉 – 神経製剤を乾燥させる;これは、その後の充填ピペットの充填時にCa 2+色素の希釈を防止する。 冷凍庫からCa 2+指示薬バイアルを取り出し、室温で暗所で解凍させる。 低倍率（10倍）の実体顕微鏡制御下で、筋肉と神経との間の接合を検出する。細かいピンセットとはさみで、 胸鰭の腹側の神経を筋肉の表面近くに切断します（ステップ2.1参照）。約2mmの神経切手を残す。 モデリングクレイを使用して、ペトリ皿上のチュービングおよびシリンジに取り付けられた充填ピペットを固定します。 ピペットの先端を神経切開の近くに動かします。 それをつまらないで、静かに充填ピペットの先端に神経断端を吸引する。 鈍い部分から吸引チューブを取り外す充填ピペットの端。 長い針が付いたシリンジを使用して、充填ピペットから余分な溶液を注意深く取り出します（ 材料表を参照）。神経切れを挟まないでください。 先端部に神経断端が吸引された状態で、充填ピペットの先端を垂直に少し持ち上げます。 石油ゼリーを使用して、充填ピペットチップの外側から神経断端の吸引された部分を断熱する。 必要に応じて、充填ピペットで絶縁された神経断端を乾燥させる：長い針を備えた注射器を用いて充填ピペットから余分な溶液を静かに吸引する。 ピペットチップが長いピペットを使用して、0.5μLの色素負荷溶液（ステップ1を参照）を引き出します。 ピペットチップを充填ピペットに静かに挿入します。混合物を神経断端に直接放出する。 充填ピペットの開放端を石油ゼリーでシールする。 リンガーの小さなアリコートを加える調製物を濡らしたままにするためにペトリ皿への凍結。 調製物を室温で暗く湿った条件下で5時間インキュベートする。 充填液を充填したピペットを取り出し、リンゲル液で調製物をすすぎ、8℃の冷蔵庫に一晩放置する。 3.顕微鏡のための組織の準備調製物をシリコンエラストマーでコーティングしたチャンバーにマウントし、鋼製のマイクロニードルでわずかに引き伸ばすように固定します。 新しいリンガー溶液のアリコートで組織をすすぐ。 神経を刺激するために吸引電極を使用する。電極の構築は、Kazakov らによる論文の無償ダウンロードから入手可能である。 、2015 32 。電極の先端を神経の切断端に近づけて配置し、電極の穴に神経断端を吸引する。 準備室を顕微鏡ステージに取り付けます。プラック温度プローブと、チャンバ内の入口および出口の点火。 ペルチエ素子に電源コードを接続します。 準備を盛り上げるには、単純な重力駆動システムを使用します。余分な溶液を除去するには、灌流吸引ポンプをオンにします。 サーモコントローラユニットの電源を入れます。 温度コントロールを20°Cに設定します。 紫外線防護シールドを取り付けます。 刺激ワイヤー電極を電気刺激装置に接続し、顕微鏡下で4倍の対物レンズを用いて筋肉収縮を観察する。 Ca 2+およびMg 2+の含有量が低いリンゲル液で灌流システムを満たす。 注：このソリューションは、筋肉の収縮を防ぐために使用されます。外部カルシウムの濃度の減少および外部マグネシウムの上昇は、Ca 2+過渡応答の振幅の減少をもたらす。しかしながら、以前の経験に基づいて、0.9mM CaCl <sub> 2および6mMのMgCl 2は、Ca 2+過渡応答の振幅を確実に解消するのにはまだ十分である。例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体の特異的ブロッカーであるd-ツボクラリンまたはアルファ – ブンガロトキシンの使用は、筋肉の痙攣を完全にまたは部分的に遮断するであろうしかし、これらの毒素の添加は、シナプス前カルシウム浸入にも影響し得る33 。これを避けるために、μ-コノトキシンGIIIAを使用することができます27 。 ポンプを入れ、低Ca 2+および高Mg 2+を含むリンゲル液で調製物の灌流を開始する。 顕微鏡の40×対物レンズに切り替えます。 スイッチをオンにする彼はモノクロメーター（ 表の表を参照）。 モノクロメータ制御ソフトウェアで488 nmの発光波長と連続照明モードを選択します。 蛍光モードでの高倍率下で、神経末端に色素が充填されていることを確認する。 図1 ：Ca 2+指示薬が充填された神経および末端。 （ A ）負荷操作後にCa 2+指示薬を充填した神経。スケールバー=200μm。 （ B ）Ca 2+指示薬で満たされた神経終末。スケールバー=20μm。 （ C ）Ca 2+ -指示薬の蛍光は、神経終末にはっきりと見える。スケールバー=20μm。_blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 Ca 2+およびMg 2+の低濃度溶液中で調製物を少なくとも30分間平衡化させる。 4.デジタルCCDカメラによるビデオキャプチャ注：蛍光信号の取り込みの詳細は、顕微鏡とカメラの種類ごとに異なりますが、主な考慮事項は画像取り込み速度です。 NMJにおける単一のCa 2+過渡状態の記録のための最小捕捉周波数として1kHzを使用する。 注：蛍光イメージングには高速デジタルCCDカメラが必要です（ 材料表を参照）。ここでは、カメラ、モノクロメータ、および刺激装置の同期にデータ収集システムとソフトウェア（ 表の表を参照）を使用しました。要するに、このプロトコルは、データのデジタル出力上に同期パルスを生成することを可能にするシャッターを開放し、ビデオ信号を捕捉し、刺激を開始するための捕捉システムを含む。すべての時間的パラメータは、プロトコルおよび/または装置上で設定することができる。典型的なプロトコルは、1kHz（80×80ピクセル）で取得された一連の500フレームです。励起光による照明は、Ca 2+インジケータを漂白し、細胞組織を光分解することができる。したがって、励起光への長時間の暴露を避けてください。このプロトコルでは、シャッターはビデオのキャプチャに必要な時間だけ開いています。特定の神経末端あたり20シリーズを取得します。ここでの目的は、対照群および薬物送達後の同じ部位をモニターすることである。 顕微鏡の4倍対物レンズの下で、明視野法を使用して筋肉と神経分岐を視覚化します。 40倍の対物レンズに切り替え、落射蛍光法と488 nmの励起波長を使用して、色素が充填された神経終末を探します。関心のある神経終末領域を特定する。 三眼チューブで顕微鏡で、光路交換レベルを選択します：100％光をカメラに照射します。 CCDカメラの取得ソフトウェアを起動します。 「ライブ」モードでは、ROIを見つけてフォーカスを調整します。 メニューの「変更」の設定を選択します。 「基本設定」は、毎秒1,000フレーム（fps）で、80 x 80の解像度で使用してください。 入力フレーム数を500に設定します。 実験の名前を入力します。 「外部トリガ」を選択します。 プリトリガ時間を10 msに設定します。 リピート数を20に設定します。 モノクロメータ制御ソフトウェアでは、488 nmの発光波長と「外部トリガ照明」モードを選択します。 データ収集ソフトウェアを実行します。 刺激プロトコールをロードする。 ビデオを録画する前に、ビデオキャプチャソフトウェアを使用して暗いフレームをキャプチャします。 刺激プロトコルを実行します。 ROIとチェクを選択k記録された信号。 5.データ分析注：データ解析には、CCDカメラソフトウェアとImageJを使用します。データは表計算プログラムで曲線として表されます。 CCDカメラソフトウェアでは、平均20回繰り返して結果をImageJサポートファイルにエクスポートします。 ImageJで、ROIと背景を選択します。 ROIからバックグラウンドを差し引く。データを比（ΔF/ F 0 -1）×100％として表し、ΔFは刺激中の蛍光の強度であり、F 0は静止時の蛍光の強度である。 CCDカメラの取得ソフトウェアで、ファイル>平均ファイルをクリックします。ファイルを選択して平均します。 [フィットファイルとして保存]をクリックして、平均化したファイルを.fitファイルとして保存します。 ImageJソフトウェアを実行します。次の手順を実行します。 画像/調整/輝度/コントラストをクリックします。 [イメージ]> [スタック]> [ツール]> [;スタックソーター。 分析>ツール> ROIマネージャーをクリックします。 平均化された.fitファイルをImageJウィンドウにドラッグアンドドロップします。 ウィンドウを拡大すると、より見やすくなります。 カーソルを動かすことによって、最後のフレームを選択して削除します（これはダークフレームです） 背景と思われる領域上の矩形ROIを選択します。それをROIマネージャーに追加する More> Multi Measureをクリックして背景を測定します。意味に注意してください。データをコピーしてスプレッドシートプログラムにエクスポートし、比率のしきい値の平均値を計算します。 「Process」→「Main」→「Subtract」をクリックして、スタックからしきい値を減算します。しきい値の平均値を入力します。 神経終末を囲む四角形のROIを選択します。これをROIマネージャーに追加します。 More> Multi Measureをクリックして測定します。意味に注意してください。それをスプレッドシートプログラムにコピーしてエクスポートします。 信号の平均オフセット。 注記：最初の数十点は刺激なしでベース色素の蛍光を示す。これは安静時の蛍光である。 安静時の蛍光で信号を分割します。 "1"を減算して100％を掛けます。 シグナルをプロットし、Ca 2+過渡応答の振幅を計算する。