JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55057
, , , ,
1Department of Hematology/Medical Oncology,University Medical Center Göttingen

Summary

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Abstract

küçük endozomal türetilmiş Eksozomlann (Exos, çap <100 nm) ve büyük plazma zarı kaynaklı microvesicles (MVs, çap> 100 nm) dahil dışı veziküller (AGH) serbest bırakılması bütün canlı hücrelerde meydana temel hücresel bir süreçtir. Geldikleri hücre için ve in vitro çalışmalar belirli Bu veziküller taşıyıcı proteinler, lipidler ve nükleik asitler arası iletişimin arabulucu olarak önemlerini sermiştir. EVs başarıyla çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir ve kan, özellikle EVs kanser veya bulaşıcı hastalıklar için biyolojik sözü olarak tespit edilmiştir. Kandaki MV alt popülasyonlarının çalışma imkan vermek üzere, periferik kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol mevcut. MVs diferansiyel santrifüjleme ile EDTA antikoagüle Plazma örneklerinden topak haline getirildi ve tipik olarak 100 bir çapa sahip olan – 600 nm. Nedeniyle büyük bir boyuta, onlarKolayca flow sitometri, rutin klinik teşhis kullanılan ve en laboratuvarlarda mevcut olan bir teknikle incelenecektir. İzole MVs kalite kontrol testleri için birkaç örnek verilecektir ve kan farklı OG alt toplulukların ayrımı için kullanılabilen işaretleyiciler sunulacaktır.

Introduction

Son yıllarda in vitro çalışmalar, birçok hücre dışı veziküller (EVS) arası iletişimde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Yaşayan hücreler sürekli boyut, içerik ve biyogenezine farklılık kesecikler döken. En iyi çalışılan AGH onlar multiveziküler organları intraluminal kesecikler olarak depolandığı endozomal sisteminden kaynaklanan eksozomlar vardır. Plazma zarı ile ikinci sigorta kez içeriyordu veziküller Eksozomlann olarak yayımlanan (Exos, çap 30-100 nm 1). Plazma zarı 2 doğrudan kapalı tomurcuk – Son yıllarda artan ilgisini topladı EV ikinci nüfus büyük microvesicles (1000 nm MVs, çapı 100) vardır.

5, ve komşu C transfer proteinlerin bir bolluk – veziküllerinin her iki tipi, örneğin, DNA, mRNA veya miRNA 3, bir lipid iki katmanının ile çevrilidir ve nükleik asitleri içerirlerarşın. Genel olarak veziküllerin protein bileşimi kökenli hücrenin durumunu yansıtırken, bazı proteinler seçici hedef ve AGH 1 zenginleştirilmiş gibi görünüyor. Bir önemli araştırma ilgi roman biyomarkırların olarak AGH kullanımına izin verebilir belirli EV imzaları belirlemek amacıyla anormal ve hastalıklı hücrelerden AGH karakterize etmektir. Özellikle tümörün kendisi kolayca erişilebilir olmadığı kanser, içinde, kanda tümör spesifik AGH hedefleyen sıvı biyopsi tedavi yanıtları izlenmesine olanak veya invaziv işlemler 6 gerek kalmadan primer tümör karakterize yardımcı olabilir.

Gerçekten de EVS başarıyla idrar 7, CSF 8, anne sütü 9 ya da kan 10 de dahil olmak üzere, çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir. Çeşitli çalışmalarda, farklı insan hastalıklarında EV sayılarında değişiklik ve kompozisyon belirledi. Örneğin, sepsis hastalarında ön pıhtılaştırma MVs sayısıdırönemli ölçüde sağlıklı bireylerin 11 oranla artmıştır. Ayrıca şiddetli serebral sıtma olan hastalarda kandaki toplam MVS bir artış görülebilir ve trombosit kaynaklı MVS sayıları koma derinliği ve trombositopeni 12 ile ilişkilidir. Diğer çalışmalar bu kardiyovasküler olaylar 13,14 daha yüksek bir olasılık ile ilişkilidir, sistemik lupus eritematozus veya kalp yetmezliği olan hastalarda ve ikincisi durumunda endotel kökenli veziküllerin yüksek sayıda rapor.

Özellikle kanser, kandaki AGH halen tanısal ve prognostik değeri olan yeni biyomarkerların olarak tartışılmaktadır. Bu MUC1, EGFR veya FAK tümör-ilişkili proteinler eksprese MVs seviyeleri meme kanserli hastaların 15,16 kanında yükselmiş olarak görülmektedir. Ayrıca EXOS için son zamanlarda yapılan çalışmalar gibi glipikan-1 erken hastalık DE izin göğüs kanseri için pankreas kanseri veya del-1 için olduğu gibi, tümör spesifik antijenler taşıyan kan türevi EXOS göstermiştiryüksek özgüllük ve duyarlılık 17,18 ile koruması. Buna ek olarak, serum kaynaklı tümör Exos gibi Kras ve tedavi tahmini 19 için kullanımlarını göstermektedir p53 gibi mutasyonların saptanması için kullanılabilir DNA içerebilir. Son gelişmeler, belirli bir mikroakışkan çip ile glioblastoma hastaların kanında EXOS bu analiz tedavisi 20 izlenmesine olanak sağlar göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular veziküllerin hastalığa özgü alt popülasyonlar analizi tanı, prognoz yanı sıra tedavi seçenekleri ve başarı hakkında değerli bilgiler verir ima.

Bununla birlikte, kan EXOS izolasyonu ve analizi, zaman alıcıdır, özel laboratuar ekipmanları gerektirir ve bu nedenle henüz rutin klinik teşhis için uygun değildir. Bunun aksine, MVs bu EXOS 18 için gerekli olan sitometri lateks boncuk çift bunları gerek kalmadan kolayca akış sitometrisi ile analiz edilebilir nedeniyle büyük bir boyuta, çok daha hızlı biçimde izole edilebilir ve21. Bu nedenle, burada kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve akış sitometrisi ile OG altgrupları müteakip özellik tayini için kullanılabilecek bir protokol mevcut. Bu protokol, daha fazla çalışma ve günlük klinik teşhis için MVS kullanmak için gerekli olacak büyük hasta gruplarında OG profilleri derinliği karakterizasyonu sağlayacaktır.

Protocol

İnsan deneklerle dahil olmak üzere tüm deneyler yerel etik kurul (onay no. 3/2/14) tarafından onaylanmıştır. Hastaların seçimi için tür, yaş, cinsiyet, mevcut tedavi rejimleri ve bu nedenle kandaki OG bileşim etkilemek olabilir ve daha pek çok çeşitli faktörler toplama 22,23 örnek önceden dikkate alınması gerektiği not edilmelidir. Plazma örneklerinin hazırlanması 1. EDTA (1.6 mg / ml kan) içeren bir vacutainer kan toplama tüpüne 21-gauge kelebek iğne ile donör başına kan 2 tüpleri – 1 çizin. verimli kan antikoagülan garanti tüp (ler) birkaç kez ters emin olun. Not: – 15 ml daha sonra akış sitometrisi ve Western Blot analizi için kan önerilen hacmi 5'tir. OG bozulmasını ve kaybını önlemek için, kan örnekleri 30 dakika kan kesildikten sonra <ele alınmalıdır. 1.200 x g'de 15 dakika süre ile numuneler santrifüj ile plazma numunelerinin hazırlanmasıOda sıcaklığında (RT). kan hücreleri (= alt tabaka) geri kalan plazma (= üst tabaka) ayrılmasını yardımcı olmak için bir valf filtre uygulanır. 15 ml tüp içine plazma aktarın. 1,500 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj, RT daha büyük hücre yıkıntıları pelet haline geri kalan trombositleri çıkarmak için. 15 ml tüp içine süpernatant aktarın ve doğrudan -20 ° C'de 6 aya kadar OG yalıtım veya mağaza örnekleri devam edin. NOT: Sunulan protokol, aynı zamanda, hücre kültür süpernatanlarından MVs (ve EXOS) izole etmek için kullanılabilir. 24 için% 80 birleşme – – bunun için, 60 hücrelerinin kültive vezikül tükenmiş FCS ile takviyeli kültür ortamında 48 saat, ve daha sonra supernatant toplamak. 750 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj kalıntı kayan hücreleri tüketir büyük hücre yıkıntıları pelet haline getirildi 1500 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika boyunca tekrar yeni bir 15 ml tüp ve santrifüj içine süpernatant doldurun. Bu yüzer madde daha sonra MVs izolasyonu için kullanılabilmektedir2.16 – Adım 2.1 açıklandığı gibi. MVS 2. izolasyonu uygun bir santrifüj tüpü içinde plazma örneği aktarın. Gerekirse, santrifüj işlemi sırasında ince duvarlı borular çöküşü numunenin seyreltilmesi ve önlemek amacıyla PBS ile tüp doldurun. 14.000 x g'de, 4 ° C'de 35 dakika boyunca santrifüje. Durusu süpernatant, tüpler ters döndü ve bir kağıt havlu üzerine koymak tutun. Kalan tüm yüzer havlu batırılmış ve bu şekilde örnek çıkarılana kadar 5 dakika – 3 bekleyin. 1000 uL PBS MV pelletini, bir masa üstü santrifüjü içinde 14,000 x g'de 4 ° C'de 35 dakika boyunca 1.5 ml tüp ve santrifüj aktarın. Süpernatant aspire. pelet boyutuna bağlı olarak, 500 ul PBS – 50 MV pelletini. Seçenek olarak ise, RIPA tamponu içinde, örneğin, doğrudan lize MVs, (150 mM NaCI /% 0.1 SDS /% 0.5 Na-deoksikolat /% 1 Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)daha sonra Western blot analizi için. -20 ° C'de saklayın MVs. Onlar birkaç ay boyunca stabil kalır, ancak tekrarlanan donma-çözülme-döngüleri önlemek olacaktır. İsteğe bağlı MV verim değerlendirmek ve daha sonraki deneyler için MVs dozlanması amacıyla bir protein tahlili ile OG protein konsantrasyonu (örneğin, Bradford ve Lowry metodu) belirler. Ek Exos Plazma örneklerinden izole edilecekse, 110,000 x g'de, 4 ° C'de, 2 saat için bir ultra-santrifuj tüpü ve santrifüj içine adım 2.3 süpernatant süzün. Aşama 2.3'te tarif edildiği gibi süpernatant tortusundan ayırma, 1000 uL PBS Exo pelet tekrar süspansiyon ve küçük (1.5 mL) ultrasantrifügasyon tüplere aktarın. 75 uL PBS veya RIPA tamponu – 50 110.000 x g'de, 4 ° C'de, aspirat süpernatan ve tekrar süspansiyon Ekzo pelet, 2 saat süre ile ultra santrifüj. Akış Sitometrisi ile MVS 3. Karakterizasyonu Aktarım 15 uL PBS +% 1 vezikül tüketilmiş sığır fetüs serumu (Fbir akış sitometrisi tüp CS). Not: Vezikül tükenmiş FCS, daha önce, 24 tarif edilen şekilde 0.2 um'lik bir filtre boyunca süpernatan 110,000 x g'de 18 saat FCS (56 ° C'de 30 dakika) ısı ile inaktive edilmiş santrifüj ve süzme yolu ile hazırlanır. PBS içinde MVs (3 ug de geçerlidir düşük verim durumunda) 5 ug ekleyin. OG yüzeyindeki spesifik olmayan bağlama merkezlerini bloke edebilir ve böylece arka plan boyama azaltmak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Protein-faiz karşı floresan etiketli antikor ekleyin. düşük bir sinyal-gürültü oranı optimal konsantrasyonunu belirlemek ve garanti etmek amacıyla kullanılmadan önce Boyama için kullanılan antikor miktarının titre edilir. Ayrıca negatif kontrol olarak lekesiz MVS ile bir tüp ve (antikor 1 ug kullanılması durumunda, örneğin, aynı zamanda izotop kontrol An 1 mikrogram kullanımı aynı konsantrasyonda eşleşen izotip kontrol antikoru ile boyandı MVS bir tüp dahil emin oluntibody) arka plan boyama ölçmek için. Not: Bu farklı fluorochromes bağlanmış bir çok antikor eklenerek sitometri renkli akış gerçekleştirmek de mümkündür. karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 250 uL PBS ilave edin ve bir akış sitometrisi kullanılarak numunenin ölçüm devam edin. halinde numuneleri hemen ölçülemez ki 4 ° C'de örnekleri ve mağaza düzeltmek için 150 uL PBS ve 50 uL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. UYARI: PFA zehirlidir. eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. mümkün olan en düşük değere akış sitometresi eşiğini azaltın ve logaritmik ölçekte yan dağılım (SSC) arsa karşı ileri dağılım (FSC) kullanılarak OG nüfus arayın. OG nüfus Kapısı ve buna karşılık gelen bir histogram floresan sinyali değerlendirir. Western Blot tarafından MVS 4. Karakterizasyonu doğrudan MV peletUygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu). Uygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu) içinde 1: MV pelet daha önce PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş durumda, en az 1 seyreltin. Lowry testi ile OG numunenin protein konsantrasyonu, örneğin, belirleme. 22.5 ul RIPA tamponunda MVS 20 ug – 10 hazırlayın. Daha sonra 95 ° C de 5 dakika boyunca 7.5 mL 4 x Laemmli yükleme tamponu ve ısıtılır. bir poliakrilamit jeli üzerinde Numuneleri ve standart protokollere göre immunoblotting gerçekleştirin. zarı üzerine proteinleri aktarıldıktan sonra, standart protokollere göre, bir yükleme kontrolü olarak bir Ponceau boyama yapar. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle TBST içinde destain membran. TBST içinde% 5 BSA, oda sıcaklığında en fazla 1 saat 30 dakika boyunca blok membran. gece boyunca ya da oda sıcaklığında 2 saat boyunca 4 ° C 'de primer antikor ile membran inkübe edin. TBST'dir 3 x 5 dakika ile membran yıkayın. 1 bir seyreltme HRP ile birleştirilmiş ikincil antikor ile membran inkübe: 10,000,% 5 BSA. Not: Yüksek plan sinyalleri durumunda yerine BSA süt tozu kullanımı. TBST 3x 5 dakika ile membran yıkayın. Bir ECL algılama reaktifi ile membran geliştirmek ve chemilüminesan film ya da bir kemilüminesans görüntüleme sistemi sinyalleri algılar. Not: EXOS gelen MVs ayırt etmek için, tubulin benzeri proteinler kullanılabilir 4-aktinin veya mitofilin esas MVs 16,25 mevcut olması gereken. EXOS için markerler olarak kullanılan en tetraspanin antikorları (örneğin, CD9, CD81), indirgeyici koşullar altında çalışmaz ve bu nedenle 70 ° C 'de 10 dakika süre ile ısıtıldı, ardından indirgeyici olmayan yükleme tamponunda hazırlanmalıdır dikkat ediniz.

Representative Results

tarif edilen protokol takip izole edilebilir MVs verimini ölçmek amacıyla, 10 donörlerin kan numunelerinden izole MVs miktarı hesaplanmıştır. Bir Lowry protein deneyinde değerlendirildi OG verim mL kan için 19.2 ug MVs (Tablo 1) 'in bir ortalama ug ila 30 kadar, 10 arasında değişmektedir. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ile tespit edilen partikül konsantrasyonu, 1.66 x 10 9'dan ml plazma, numune başına 5.9 x 10 9 parçacıklar (Tablo 2), ortalama 2.36 x 10 ila 10 arasında değişmektedir. Transmisyon elektron mikroskobu ile MVs ileri karakterizasyonu bir lipit çift katmanı ile çevrili ve herhangi bir hücre organelleri (Şekil 1A) içermeyen bir çapı> 100 nm olan veziküller nüfusu ortaya koymuştur. NTA izole MVs büyüklüğü 600 nm (Şekil 1 b) ve ortalama OG boyutuna kadar 100 arasında değişmektedir doğruladı 201 idimil (Şekil 1C). Western Blot tarafından tipik OG ve Exo belirteçleri için boyama izole MVs tubulin pozitif ve Exos tubulin negatif ve BS9 ve CD81 (Şekil 2) zenginleştirilmiş ise sadece, BS9 ve CD81 hafif bir ifade gösterdi olduğunu gösterdi. Akış sitometrisi (Şekil 3A) izole MVs analizi, normal olarak hücre kültür süpernatanlarından izole MVs için kullanılan ile aynı parametreler kullanılarak kapı olabilir tanımlanmış bir vezikül popülasyonu ortaya ve PBS ölçümü ile elde edilen arka plan sinyali açıkça farklıdır + % 1 MVs (Şekil 3B) ilavesi olmaksızın FCS veziküller tükenmiş. Kanda mevcut farklı OG popülasyonları analiz etmek için, MVs ör CD62P, trombosit türevli MVS, CD45 lökosit-türevi MVS, CD235a, farklı kan hücre popülasyonları için kurulan işaretleri ile boyandıKırmızı kan endotel hücre-türevli MVs (Şekil 4) MVs ve CD62E hücre kökenli. Bu nitelendirme MVs çoğunluğu tüm örneklerde trombositler tarafından döken gibiydi iken OG alt popülasyonlar yüzdesi araştırılmıştır donör kan örnekleri arasında farklılık göstermiştir. Şekil 1: periferik kandan izole MVs boyutları dağılımı. A, izole edilmiş MVs transmisyon elektron mikroskobu ile görülür hale getirilirler. B, veziküllerin boyut dağılımına gösteren MVs temsili nanopartikül izleme analizi (NTA). C, 10 bağımsız hazırlıkları ortalama MV boyutu NTA (ortalama) ile ölçüldü. Al görmek için buraya tıklayınızBu rakamın Arger sürümü. Şekil 2: Western Blot ile izole edilmiş MVs karakterizasyonu. İki vericilerden izole MVs ve EXOS Diferansiyel Protein ifadesi, western lekeleme ile görselleştirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: Akış Sitometrisi ile MVS analizi. A, MVs ilk ilgili OG nüfus kapısına sidescatter (SSC) araziler karşı ileri (FSC) görsel edilir. Daha sonra, bu MVs ilgili antijen tarafından karakterize edilir antijene karşı floresan etiketli antikorlar kullanılarak. B, iki donörlerin plazmadan izole MVS SSC araziler karşı Tipik FSC. Karşılaştırma olarak, sadece PBS +% 1 vezikül tükenmiş MVs olmayan FCS kullanarak hücre kültürü üstte yüzen hem de bir negatif kontrol izole A549 akciğer kanseri hücreleri, tümör hücresi türevli MVs için tipik bir arsa sağ tarafta gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4: Akış Sitometrisi ile İzole MVS karakterizasyonu. Üç vericiden MVs akış sitometrisi ile oluşturulan kan hücre belirteçleri (kırmızı) ekspresyonu için karakterize edilmiştir. İlgili izotip kontrolleri gri renkle gösterilir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Örnek MVs / ml kan [ug] 1. 29.4 2. 10.3 3. 15.2 4. 31.1 5. 18.8 6. 22.7 7. 19.1 8. 18.7 9. 15.0 10. 11.9 Tablo 1: Periferik Kan Örneklerinden OG Protein Verimi. </strong> Gösterilen 10 donörlerden alınan mL periferik kandan başına MVS miktarıdır. OG verimleri Lowry testi ile ölçülmüştür. Örnek MVs / ml plazma [partikül sayımı] 1. 6.42E + 09 2. 2.36E + 10 3. 1.88E + 09 4. 6.51E + 09 5. 3.48E + 09 6. 4.57E + 09 7. 2.09E + 09 8. 1.66E + 09 9. 2.54E + 09 10. 6.20E + 09 Tablo 2: Periferik Kan Örneklerinden MV Parçacık Verim. </stRong> MV 10 donörler ve partikül sayımları nanoparçacık izleme analizi ile belirlendi plazma örneklerinden izole edilmiştir. Üç bağımsız ölçümün ima edilen bir değerdir gösterilmiştir.

Discussion

Kandaki EVs üzerinde son çalışmalar, EV kompozisyon ve sayımlar çeşitli hastalıkların nedeni sırasında değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu AGH analizi ve ileri karakterizasyon daha fazla teşhis ve prognoz için hastalık biyobelirteçlerinin olarak potansiyel kullanımını değerlendirmek ya da tedavi yanıtları değerlendirmek için yüksek ilgi görmektedir. Burada mevcut protokol herhangi bir hücre organellerini içermeyen 600 nm çapında veziküllerin izolasyonu sağlar. Bu gözlemler MVS güncel bir tanımlama ile uyumlu ve apoptotik cisimlerin 2 varlığını dışlamak. genellikle Ekzo belirteç olarak kullanılan tetraspanins CD9 ve CD81 sadece biraz ifade edildi Western Blot kullanarak, izole edilmiş MVs tubulin yüksek ifade gösterdiği göstermek mümkün oldu. Bu MVs Exos farklı olduğunu teyit ve proteomik 25 tarafından son derinlemesine karakterizasyonu ve hem EV popülasyonlarının karşılaştırmak için uyuyor.

Kan örneklerinin elde edilmesi sırasında içeriği ">, MV bozunmasını önlemek için, kısa sürede damar delinerek ve plazma hazırlama arasındaki zaman kalması açısından çok önemlidir. Ayrıca, kan örneklerinin uzun süreli depolama geliştirilmiş MV neden kan hücrelerinin aktivasyonuna yol açabilir sonuçta apoptotik cisimlerin salınımına neden apoptoz dökülme ve. OG izolasyonu için bir başka önemli husus nedenle, aşağı iplik sonra mümkün olduğunca süpernatant kadar çok kaldırmak için kritik öneme sahiptir. plazma proteinlerine veya daha küçük Exos MV hazırlıkları kirletmesini önlemek için topak, normal olarak görünür ve sıkı bir şekilde borunun duvara bağlı olduğu 14,000 x g'de MVs., süpernatan kolay bir pipet ucu ile temizlenebilir. EXOS aksine yüksek hızlı ultra-santrifüj tarafından hazırlanması sırasında agregatlar oluşturması için eğilimi olan genellikle tekrar süspansiyon zor bu sorun MVs oluşmaz.

Çalışmamız bu Possi olduğunu gösterirflow sitometri ile kanda bulunan OG subpopülasyonunun karakterize etmek için ble. En akış sitometrelerinde tespit limiti yaklaşık 200 olmasına rağmen – 300 nm, MVs tekrarlanabilir açıkça arka plan sinyallerinden kendi ayrım izin Aynı analiz parametreleri ve kapıları ile donör yanı sıra hücre kültürü örneklerinde ölçüldü. PBS akış sitometrisi (Şekil 3) sırasında yüksek bir arka plan neden olabilecek herhangi bir kirletici partiküller ihtiva etmez analizler için kullanılan ölçümlerinden önce kontrol edilmesi önemlidir. Bazı küçük MVs bir akış sitometri yaklaşımla ele olmayabilir rağmen, tüm büyük kan hücre popülasyonlarının (örneğin, trombositler, kırmızı kan hücreleri, lökositler, endotel hücreleri) MVS tespit edildi. 29 – Bizim analizlerde daha önce MVS 26 bulunmuştur farklı kan hücreleri için standart belirteçler kullanılır. Belirtilmelidir ki t akış sitometrisi ile mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek içinO miktar ve antikor konsantrasyonu, söz konusu antijeni ifade eden bir MV numune üzerinde titre edilmelidir. Kanda spesifik MV alt popülasyonlar daha yüksek özgüllük ile tespit edilir ise, ilgili MVS iki farklı antijenlerin karşı çifte boyama gerçekleştirmek ve sonraki 23 analizleri için yalnızca tüm çift pozitif MVS dikkate almak mümkündür. Şu anda, sağlıklı bireylerin 23,30 kanında MV alt popülasyonlar standart bir dizi tanımlamak için çabalar vardır. Bu çalışmalar, daha önce trombosit türevli MVs gözlemlerimiz ile uyumlu olarak bir kan MVs büyük nüfus oluşturmaktadır göstermiştir.

OG örnekleri karakterize etmek flow sitometri bir avantajı, bu yöntem zaten iyi günlük klinik teşhis biyomarkırların olarak MVs olası kullanımını sağlayacak birçok klinik merkezlerinde tanı amaçlı kurulmuş olmasıdır. çoğunlukla odak kandaki EVs önceki çalışmalarküçük Exos üzerinde ed, seçici istenen Exo hedef nüfusu 31,32 analiz özel sıralama prosedürleri ya güvenmek ya da analiz 18 öncesinde boncuk Latexe Exos birleştirilmesi ile zaman alıcı (2 gün) izolasyon süreci gerektirir. Kendi yayınlanmamış gözlemler tam kan hazırlıkları MVS akım sitometri analizi bile böyle böyle bir seçim süreçleri olmadan tümör kaynaklı MVS olarak MVS algılanmasını sağlar düşündürmektedir.

Burada sunulan protokol standardı laboratuar ekipmanları ile periferik kan örneklerinden MVs hızlı izolasyonuna izin verir ve onların sonraki karakterizasyonu akım sitometri ve Western Blot kullanarak, birlikte ele alındığında. Bütün bu süreç hastalık biyobelirteçlerinin olarak MVs potansiyelini değerlendirmek için gerekli olan hastaların kanındaki OG profilleri gelecek çalışmalara kolaylaştıracaktır yaklaşık 2 saat içinde yapılabilir.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Materials

butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56°C)
filter 0.22µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

Tags

MicrovesiclesPeripheral BloodPlasmaCentrifugationFlow CytometryCharacterizationProtein ConcentrationProinvasiveMetastasisTumor PatientsEDTAPBSFCSAntibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image