JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Выделение и характеристика Микровезикулы из периферической крови

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55057
, , , ,
1Department of Hematology/Medical Oncology,University Medical Center Göttingen

Summary

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Abstract

Выпуск внеклеточного везикул (EVS) включая малые эндосомальных производные экзосомы (Exos, диаметр <100 нм) и большие плазменные мембраны полученных микропузырьков (MVS, диаметр> 100 нм) является фундаментальным клеточный процесс, который происходит во всех живых клетках. Эти везикулы транспортные белки, липиды и нуклеиновые кислоты , специфичные для их клетки происхождения и в пробирке исследования выявили их важность как медиаторы межклеточной коммуникации. Электромобили были успешно изолированы от различных жидкостей организма и особенно электромобили в крови были определены как перспективные биомаркеров для злокачественных опухолей или инфекционных заболеваний. Для того, чтобы обеспечить изучение MV субпопуляций в крови, мы приводим протокол для стандартизированной изоляции и характеристики MVs из образцов периферической крови. Материализованные осаждали из ЭДТА антикоагулянтом образцов плазмы дифференциальным центрифугированием и, как правило, обладают диаметром 100 – 600 нм. Из-за их больших размеров, они могутлегко быть изучены с помощью проточной цитометрии, метод, который обычно используется в клинической диагностике и имеющихся в большинстве лабораторий. Несколько примеров для контроля качества анализов выделенных MVs будет дано и будут представлены маркеры, которые могут быть использованы для различения разных MV субпопуляций в крови.

Introduction

В последние годы многие в пробирке исследования показали , что внеклеточные везикулы (ЕДС) играют важную роль в межклеточной коммуникации. Живые клетки постоянно проливают везикулы, которые различаются по размеру, содержанию и биогенеза. Наиболее изучены электромобили являются экзосомы, которые происходят из системы эндосомный, где они хранятся в виде внутрипросветных везикул в мультивезикулярных тел. После того, как второй плавкий предохранитель с плазматической мембраной, содержащиеся в нем пузырьки выпускаются в качестве экзосомы (EXOS, диаметр 30 – 100 нм , 1). Вторая популяция EV , которая получила все большее внимание в последние годы большие микровезикулами (MVS, диаметр 100 – 1000 нм) , которые бутона от непосредственно из плазматической мембраны 2.

Оба типа везикул окружены липидный бислой и содержат нуклеиновых кислот, например, ДНК, мРНК или микроРНК 3 – 5, а также множество белков , которые они могут передавать в соседний Cгезов. В то время как в целом белковый состав везикул отражает состояние клетки происхождения, некоторые белки , как представляется, избирательно нацелены и обогащенный на электромобили 1. Одним из основных научных интересов, чтобы охарактеризовать EVs от аномальных и больных клеток, чтобы определить конкретные подписи EV, которые могли бы позволить использовать электромобили в качестве новых биомаркеров. Особенно при раке, в которой часто сама опухоль не легко доступна, жидкие биопсий , ориентированные опухольспецифические EVs в крови может позволить мониторинг реакций терапии или помочь характеризующее первичной опухоли без необходимости инвазивных процедур 6.

Действительно, электромобили уже были успешно выделены из различных жидкостей организма , включая мочу 7, 8, CSF грудное молоко 9 или крови 10. Ряд исследований позволил выявить изменения в EV подсчетов и композиции в различных заболеваний человека. Например, у пациентов с сепсисом количество про-коагулянта MVs являетсязначительно увеличилась по сравнению со здоровыми людьми 11. Также у больных с тяжелой церебральной малярии увеличение общего MVs в крови может наблюдаться и подсчеты тромбоцитарных MVs коррелирует с глубиной комы и тромбоцитопении 12. Другие исследования показывают повышенные количества эндотелием везикул у пациентов с системной красной волчанкой или сердечной недостаточности и в случае последнего, это коррелирует с более высокой вероятностью развития сердечно – сосудистых событий , 13,14.

Особенно при раке, электромобили в крови в настоящее время обсуждаются в качестве новых биомаркеров с диагностическое и прогностическое значение. Уровни MVs , экспрессирующих опухолевые-ассоциированных белков , таких как MUC1, EGFR или ФСП , кажется, повышается в крови больных раком молочной железы 15,16. Кроме того, для EXOS, недавние исследования показали, что кровь полученных EXOS, несущих опухоль-специфичные антигены, такие как глипикан-1 для рака поджелудочной железы или Del-1 для рака молочной железы на ранней стадии болезни позволяют дес высокой СРЕДЫ специфичности и чувствительности 17,18. Кроме того, сыворотка происхождения опухоль Exos может содержать ДНК , которые могут быть использованы для обнаружения мутаций , таких как KRAS и р53 , которые предполагает их использование для прогнозирования терапии 19. Последние достижения показали , что анализ EXOS в крови больных глиобластомы с помощью специального микрожидкостных чип позволяет осуществлять мониторинг терапии 20. Взятые вместе, эти находки указывают на то, что анализ по конкретным болезням субпопуляций везикул дает ценную информацию о диагнозе, прогнозе, а также терапевтических возможностей и успеха.

Тем не менее, выделение и анализ EXOS из крови отнимает много времени, требует специального лабораторного оборудования и, следовательно, еще не подходит для рутинных клинической диагностики. В противоположность этому , Материализованные можно выделять гораздо быстрее и, из – за их большего размера, могут быть легко проанализированы с помощью проточной цитометрии , без необходимости пару них с латексными шариками , как это необходимо для EXOS 18, 21. Таким образом, здесь мы приводим протокол, который можно использовать для стандартизированного выделения MVs из образцов крови и последующего определения характеристик MV субпопуляций с помощью проточной цитометрии. Этот протокол позволит в дальнейшем изучении и в глубине характеристики профилей MV в больших группах пациентов, которые будут необходимы для того, чтобы использовать материализованные для повседневной клинической диагностики.

Protocol

Все эксперименты, включая человека предметы были одобрены местным комитетом по этике (утверждение нет. 3/2/14). Для выбора пациентов следует отметить , что ряд факторов , таких как возраст, пол, современные схемы терапии и многое другое может влиять на состав МВ в крови и , следовательно , должны быть приняты во внимание до начала сбора образца 22,23. 1. Подготовка пробы плазмы Ничья 1 – 2 пробирки крови на донора через бабочку иглой 21-го калибра в Vacutainer пробирку для сбора крови, содержащей ЭДТА (1,6 мг / мл крови). Убедитесь в том, чтобы инвертировать трубки (S) несколько раз, чтобы гарантировать эффективную антикоагулянты крови. Примечание: Рекомендуемый объем крови для последующей проточной цитометрии и вестерн-блот анализа 5 – 15 мл. Для того, чтобы предотвратить деградацию милливольтах и ​​потерю, образцы крови должны быть обработаны <30 мин после забора крови. Подготовка образцов плазмы путем центрифугирования образцов в течение 15 мин при 1200 х г впри комнатной температуре (RT). Применение фильтра клапана для того, чтобы помочь разделению плазмы (= верхний слой) из оставшихся клеток крови (= нижний слой). Перенесите плазму в пробирку 15 мл. Центрифуга в течение 15 мин при 1500 мкг, RT, чтобы осадить больше остатков клеток и удалить оставшиеся тромбоциты. Передача супернатант в 15 мл трубки и непосредственно приступить к MV изоляции или хранения образцов на срок до 6 месяцев при -20 ° C. Примечание: Представленный протокол также может быть использован для выделения материализованные (и EXOS) из супернатантов клеточных культур. Для того чтобы сделать это, культивировать клетки при 60 – 80% сплошности в течение 24 – 48 ч в культуральной среде, дополненной везикул обедненного FCS, а затем собирают супернатант. Центрифуга в течение 5 мин при 750 х г, 4 ° С, чтобы истощить остаточных плавающих клеток, заполнить супернатант в новую 15 мл трубки и центрифуги снова в течение 5 мин при 1500 х г, 4 ° С до гранул большего размера остатков клеток. Этот супернатант может быть использован для изоляции MVsкак описано в шаге 2.1 – 2.16. 2. Выделение MVs Переносят образец плазмы в подходящем центрифужную пробирку. При необходимости, заполнить трубу с PBS для того, чтобы разбавить пробу и предотвратить коллапс тонкостенных труб во время процедуры центрифугирования. Центрифуга в течение 35 мин при 14000 х г, 4 ° C. Слить супернатант, держите пробирки перевернуть вверх дном и положить на бумажное полотенце. Подождите 3 – 5 мин, пока все оставшиеся супернатант был замачивают в полотенце и таким образом удалены из образца. Ресуспендируют осадок MV в 1000 мкл PBS, переносят в 1,5 мл трубки и центрифуги в течение 35 мин при 14000 х г, 4 ° C в настольной центрифуге. Отберите супернатант. Ресуспендируют осадок MV в 50 – 500 мкл PBS, в зависимости от размера гранул. В качестве альтернативы, лизируют Материализованные непосредственно, например, в RIPA буфере (150 мМ NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-деоксихолат / 1% Тритона Х-100/50 мМ Трис, рН 7,2)для последующего анализа вестерн-блот. Храните MVs при -20 ° C. Они будут оставаться стабильными в течение нескольких месяцев, но избежать повторных замораживания-оттаивания-циклов. Дополнительно: Определить концентрацию белка MV с помощью анализа белка (например, Bradford или метод Лоури) с целью оценки урожайности MV или дозы материализованные для последующих экспериментов. Если дополнительные Exos должны быть выделены из образцов плазмы, декантируют супернатант из шага 2.3 в ультрацентрифугирования пробирку и центрифугируют в течение 2 ч при 110000 х г, 4 ° C. Декантируют супернатант, как описано на стадии 2.3, ресуспендируют Exo осадок в 1000 мкл PBS и переносят в маленькие (1,5 мл) ультрацентрифугирования пробирки. Ультрацентрифуга в течение 2 ч при 110000 х г, 4 ° C, аспирация супернатант и ресуспендируют Exo гранул в 50 – 75 мкл PBS или буфера Рипа. 3. Характеристика MVs методом проточной цитометрии Передача 15 мкл PBS + 1% везикул обедненного фетальной телячьей сыворотки (FCS) в проточной цитометрии трубки. Примечание: везикул обедненного FCS получают путем центрифугирования инактивированной нагреванием (30 мин при 56 ° C) FCS в течение 18 ч при 110000 х г и фильтрование супернатант через фильтр с размером пор 0,2 мкм , как было описано ранее 24. Добавьте 5 мкг (в случае низких выходов 3 мкг также применимы) от MVs в PBS. Инкубируйте образцы в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания на поверхности MV и тем самым уменьшить фоновое окрашивание. Добавление флуоресцентно меченого антитела против доли белка из-. Титрование количества антитела, используемого для окрашивания до использования с целью определения оптимальной концентрации и гарантировать низкий рацион сигнала к шуму. Обязательно также включать в себя одну трубку с неокрашенных MVs в качестве отрицательного контроля и тюбика MVs окрашивали антителом соответствие контрольного изотипа при той же концентрации (например, при использовании 1 мкг антитела, также используют 1 мкг контрольной изотип А.Н.tibody) для количественного определения фонового окрашивания. Примечание: Можно также выполнить поток многоцветную цитометрии путем добавления нескольких антител соединенных с различными люминофоры. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавьте 250 мкл PBS и продолжить измерения образца с использованием проточного цитометра. В случае, если образцы не могут быть непосредственно измерены, добавьте 150 мкл PBS и 50 мкл 4% параформальдегида (PFA) для фиксации образцов и хранят при температуре 4 ° С. ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным. Используйте перчатки и соответствующие средства индивидуальной защиты. Снизить порог потока цитометр до минимально возможного значения и поиск для населения MV с помощью рассеяния вперед (FSC) в зависимости от бокового рассеяния (SSC) участок в логарифмическом масштабе. Ворота на население MV и оценивать флуоресцентного сигнала в соответствующей гистограммы. 4. Характеристика MVs помощью Вестерн-блоттинга Ресуспендируют осадок MV непосредственно вподходящий буфер для лизиса (например, РИПО буфер). В этом случае осадок MV уже повторно суспендировали в PBS, разбавить ее , по меньшей мере , 1: 1 в подходящем буфере для лизиса (например, РИПА буфер). Определить концентрацию белка в образце MV, например, с помощью анализа Лоури. Подготовьте 10 – 20 мкг MVs в 22,5 мкл RIPA буфера. Затем добавляют 7,5 мкл 4х Laemmli буфера для загрузки и высокую температуру в течение 5 мин при 95 ° С. Загружают образцы на геле полиакриламида и выполняют электрофореза и иммуноблоттинга в соответствии со стандартными протоколами. После переноса белков на мембрану, выполняют окрашивание пунцовый в качестве нагрузочного контроля в соответствии со стандартными протоколами. Destain мембрана в TBST в течение 5 мин при комнатной температуре. Блок мембрана в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре в 5% БСА в TBST. Инкубируйте мембраны с первичным антителом при 4 ° С в течение ночи или в течение 2 ч при комнатной температуре. Промойте мембрану с TBST 3 х 5 мин. Инкубируйте мембрану с пероксидазой хрена в сочетании вторичным антителом при разведении 1: 10000 в 5% бычьего сывороточного альбумина. Примечание: В случае высоких фоновых сигналов, используют молочный порошок вместо БСА. Промойте мембрану с TBST 3x 5 мин. Разработка мембраны с реагента для детекции ECL и обнаружения сигналов на ХЛ пленок или системы хемилюминесценции визуализации. Примечание: Для того , чтобы различать материализованные из EXOS, белки , такие как тубулина, актинины-4 или mitofilin могут быть использованы , которые должны присутствовать в основном на MVs 16,25. Обратите внимание , что большинство тетраспанины антитела (например, CD9, CD81), используемые в качестве маркеров для EXOS, не работают в восстановительных условиях и , следовательно , должны быть подготовлены в невосстанавливающей загрузки буфера с последующим нагреванием в течение 10 мин при 70 ° С.

Representative Results

Для того, чтобы количественно оценить выход MVs, которые могут быть выделены после описанного протокола, мы рассчитали количество MVs, выделенных из образцов крови 10 доноров. Выход М.В., которую оценивали в анализе на протеин по Лоури, составлял от 10 до 30 мкг при среднем значении 19,2 мкг MVs на мл крови (таблица 1). Концентрация частиц определяли анализом трекинга наночастицами (NTA) варьировала от 1,66 х 10 9 до 2,36 х 10 10 , со средним значением 5,9 х 10 9 частиц на мл образца плазмы (таблица 2). Дальнейшая характеристика МВС с помощью просвечивающей электронной микроскопии выявили популяцию везикул с диаметром> 100 нм , которые были окружены липидный бислой и не содержат каких – либо клеточных органелл (рис 1А). NTA подтвердил , что размер выделенных MVs колебалась от 100 до 600 нм (рис 1б) и среднего размера MV был 201нм (рис 1C). Окрашивание для типичных MV и Исх маркеров с помощью Вестерн – блоттинга показал , что выделенные MVs были положительными для тубулина и только показал небольшое выражение CD9 и CD81, в то время как Exos были отрицательными для тубулина и обогащены CD9 и CD81 (Рисунок 2). Анализ выделенного MVs методом проточной цитометрии (фиг.3А) показал определенной популяции везикул , которые могут быть стробированием с использованием тех же самых параметров , обычно используемых для MVs , выделенных из супернатантов клеточных культур , и это было явно отличается от фонового сигнала , полученного при измерении PBS + 1% везикулы обедненного FCS без добавления MVs (фиг.3В). Для того чтобы проанализировать различные популяции MV , присутствующие в крови, MVs окрашивали с установленными маркерами для различных популяций клеток крови, например, CD62P для тромбоцитарных MVs, CD45 для лейкоцитарного происхождения MVs, CD235a длякрасных кровяных клеток , полученных материализованные и CD62E для эндотелиальных клеток , полученных MVs (рисунок 4). Эта характеристика показывает, что процент MV субпопуляций отличался среди исследованных образцов донорской крови, в то время как большинство MVs, казалось бы пролить тромбоцитов во всех образцах. Рисунок 1: Размер Распределение MVs выделенных из периферической крови. A, изолированных Материализованные визуализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Б, анализ отслеживания представитель наночастицами (NTA) из MVs , иллюстрирующих распределение по размерам везикулы. C, средний размер MV от 10 независимых препаратов измеряли с помощью NTA (среднее значение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть альARGER версия этой фигуры. Рисунок 2: Характеристика изолированных MVs помощью Вестерн – блоттинга. Дифференциальная экспрессия белка на изолированных MVs и EXOS от двух доноров визуализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Анализ MVs с помощью проточной цитометрии. A, MVs сначала визуализируются на прямом (FSC) в сравнении с sidescatter (SSC) участков для ворот на соответствующей популяции MV. Впоследствии эти Материализованные характеризуются для интересующего антигена путем с использованием флуоресцентно меченных антител, направленных против антигена. В, по сравнению с ЛПС Типовая ЦМК участков для MVs , выделенных из плазмы двух доноров. По сравнению, типичный участок для опухолевых клеток, полученных MVs из раковых клеток А549 легких, выделенных из супернатанта культуры клеток, а в качестве отрицательного контроля, используя только PBS + 1% пузырек обедненного FCS без MVs показаны справа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: Характеристика изолированных MVs методом проточной цитометрии. Материализованные из трех доноров были охарактеризованы для экспрессии установленных клеточных маркеров в крови (красный) с помощью проточной цитометрии. Соответствующие управления изотипные показаны серым цветом.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Образец MVS / мл крови [мкг] # 1 29,4 # 2 10.3 # 3 15,2 # 4 31,1 # 5 18,8 # 6 22,7 # 7 19,1 # 8 18,7 # 9 15,0 # 10 11,9 Таблица 1: MV Белок Выход из периферической проб крови. </strOng> Показана количество MVs на мл периферической крови, которая была взята из 10 доноров. выходы MV были определены количественно с помощью анализа Лоури. Образец MVS / мл плазмы [количество частиц] # 1 6.42E + 09 # 2 2.36E + 10 # 3 1.88E + 09 # 4 6.51E + 09 # 5 3.48E + 09 # 6 4.57E + 09 # 7 2.09E + 09 # 8 1.66E + 09 # 9 2.54E + 09 # 10 6.20E + 09 Таблица 2: MV частиц Выход из периферической проб крови. </stRong> MV были выделены из образцов плазмы 10 доноров и количества частиц определяли с помощью анализа отслеживания наночастицами. Показано среднее значение из трех независимых измерений.

Discussion

Недавние исследования на электромобили в крови показали, что EV состав и рассчитывает изменить во время причиной ряда заболеваний. Таким образом, анализ и дальнейшая характеристика этих электромобили имеют большой интерес для дальнейшей оценки их потенциального использования в качестве биомаркеров заболеваний для диагноза и прогноза или оценки ответов терапии. Протокол мы представляем здесь позволяет изолировать везикул с диаметром до 600 нм, которые не содержат каких-либо клеточных органелл. Эти наблюдения находятся в соответствии с текущим определением MVs и исключает наличие апоптотических тел 2. Используя Вестерн-блоттинга, мы смогли продемонстрировать, что выделенные MVs показывают высокий уровень экспрессии тубулина, в то время как тетраспанины CD9 и CD81, которые часто используются в качестве маркеров Исх были лишь слабо выражены. Это подтверждает , что MVs отличаются от EXOS и подходит к недавней характеристике углубленного и сравнения обеих популяций EV протеомика 25.

Содержание "> Во время сбора проб крови, важно, чтобы держать время между венепункции и плазменной подготовки как можно более коротким, чтобы предотвратить деградацию MV. Более того, длительное хранение проб крови может привести к активации клеток крови вызывает повышенную MV проливая и в конечном счете, апоптоз, что приводит к высвобождению апоптотических тел. Еще одним важным фактором для MV изоляции для предотвращения загрязнения препаратов MV с белками плазмы или меньших EXOS. Поэтому очень важно, чтобы удалить как можно больше супернатанта, насколько это возможно после того, как спиннинг вниз МВС при 14000 х г. Так как гранулы, как правило, видны и плотно прикреплена к стенке трубки, супернатант можно легко удалить с помощью кончика пипетки. в отличие от EXOS, которые имеют тенденцию к образованию агрегатов при подготовке высокой скоростью ультрацентрифугирования и часто трудно ресуспендируют, эта проблема не возникает с MVs.

Наше исследование показывает, что возBLE охарактеризовать MV субпопуляций, присутствующие в крови с помощью проточной цитометрии. Хотя предел обнаружения большинства цитометров составляет около 200 – 300 нм, MVs были воспроизводимо измеряется в донора, а также образцов клеточных культур, с теми же параметрами анализа и ворота, которые явно разрешены свое отличие от фоновых сигналов. Важно , чтобы проверить перед измерениями , что PBS , используемых для анализа не содержит каких – либо загрязняющих частиц , которые могут вызвать высокий фон во время проточной цитометрии (рисунок 3). Хотя некоторые небольшие MVs не могут быть захвачены в проточной цитометрии подход, мы обнаружили материализованные из всех основных популяций клеток крови (например, тромбоциты, эритроциты, лейкоциты, эндотелиальные клетки). В нашем анализе мы использовали стандартные маркеры для различных клеток крови , которые были найдены ранее на MVs 26 – 29. Следует отметить, что для того, чтобы получить наилучшие результаты с помощью проточной цитометрии, тон количество и концентрацию всех антител следует титровать на образце М. В., выражающего интерес антиген. Если специфические субпопуляции MV в крови , должны быть идентифицированы с более высокой избирательностью , то можно выполнить двойное окрашивание против двух различных антигенов , присутствующих на соответствующих MVs и только рассмотреть все двойные положительные материализованные для последующего анализа 23. В настоящее время существуют усилия по определению стандартный набор MV субпопуляций в крови здоровых людей 23,30. Эти исследования уже показали, что тромбоцитарные MVs составляют самую большую популяцию MVs в крови, которая в соответствии с нашими наблюдениями.

Одним из преимуществ проточной цитометрии для характеристики образцов MV является то, что этот метод уже хорошо зарекомендовали себя для диагностических целей в большинстве клинических центров, которые позволили бы возможное использование MVs в качестве биомаркеров в повседневной клинической диагностике. Предыдущие исследования на электромобили в крови, которые ориентируются в основномред на меньших EXOS, опираются либо на конкретных процедурах сортировки выборочно анализировать нужную Exo целевую популяцию 31,32 или требуют больших затрат времени (2 дня) процесс изоляции с сочетания EXOS с латексными шариками до анализа 18. Наши собственные неопубликованные наблюдения указывают на то, что анализ цитометрии потока MVs из целых препаратов крови даже позволяет обнаруживать MVs такие как полученные из опухоли MVs без каких-либо подобных процессов отбора.

Взятые вместе, протокол, представленный здесь позволяет быстро изоляцию MVs из образцов периферической крови со стандартной лабораторной техники и их последующая характеристика с использованием проточной цитометрии и Вестерн-блоттинг. Весь процесс может быть осуществлен в пределах 2 ч, что будет способствовать будущих исследований по профилям MV в крови пациентов, которые необходимы для оценки потенциала MVs в качестве биомаркеров заболеваний.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Materials

butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56°C)
filter 0.22µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

Tags

MicrovesiclesPeripheral BloodPlasmaCentrifugationFlow CytometryCharacterizationProtein ConcentrationProinvasiveMetastasisTumor PatientsEDTAPBSFCSAntibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image