겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경
Summary
This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
Abstract
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Introduction
하나의 세포가 장기의 분화와 성장하는 동안 어떻게 행동하는지 이해 공장 개발의 핵심 질문 중 하나입니다. 이상적으로는, 유전자의 발현 패턴과 세포 내 단백질 위치 파악 등 셀룰러 이벤트는, 조직의 확대 상황에 비추어 볼 수있다. 이 목적은 기술 문제를 제기하고 높은 공간과 전체 장기 관찰뿐만 아니라 사진 독성 효과를 일으킬 수 있습니다 시간의 연장 기간 동안 시간 해상도를 필요로한다. 식물이 환경 변화에 빠르게 적응하기 때문에, 성장 조건은 엄격하게 제어되어야한다. 식물의 생리적 상태를 방해하지 않으면 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 세 가지 샘플 챔버에서, 1)의 성장 조건을 확보 할 수있다, 2) 안정 장시간 장착 샘플, 3), 촬상 낮은 조명 강도와 사진의 손상 및 비 생리적 조건을 방지 할 수 있습니다.
생리 성장 컨디셔닝현미경 시료 챔버의 기능이 장기간 실험 중요하다. 3 – 공 초점 현미경 (1)에 대해 촬상의 성장 챔버를 설명 가능한 프로토콜들이있다. 그러나, 공 초점 현미경은 스트레스 반응을 일으킬 수있는 식물, 높은 광 강도를 소개하고 일반적으로 4 성장을 억제한다. 또한 대부분의 기존의 현미경은 그들 자신의 방향을 중력의 벡터으로 성장하려고하기 때문에 식물을위한 최적하지 않은 샘플의 수평 위치 할 수 있습니다. 9 – 지난 10 년 동안, 빛 시트 현미경은 몇 일 5까지의 기간에 대한 세포 해상도에서 큰 표본의 개발을 캡처 할 수있는 강력한 도구로 떠오르고있다. 빛 시트 현미경 수직 표본의 위치를 허용하고 점점 루트 개발 (10) 연구 식물 연구에 사용되는 – 최근 베르트 검토 (21),t과 Maizel 22. 언급 된 연구 중 많은 10,13 – 18,21 최적화 샘플의 특별한 방법을 채용 에른스트 HK Stelzer의 실험실에서 수행 하였다는 겔 (17)의 표면에 뿌리를 성장하는 것을 특징으로 실장. 이 연구에서, 주문 제작 현미경이있는 공장은 바닥에서 개최, 사용되었다. 반대로, 널리 사용 가능한 광 시트 현미경의 대부분은 상부로부터 샘플을 잡아. 따라서, 특정 제조 방법에 용이하게 적용 할 수 없다. 여기에 제시된 방법은 OpenSPIM (23), 적용하고 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)을 향상시키기위한 오픈 액세스 플랫폼에 적용 할 수있는 잘 확립에 표면 장착 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목적은 OpenSPIM 광 시트 현미경 애기 뿌리 장기 촬상을 가능하게하는 것이다. 이것은들에 똑바로 식물 성장에 의해 달성된다액체 배지에서 뿌리 겔 urface는 나뭇잎이 공중에 남아있다. 식물의 광합성 활성을 보장하기 위하여, 맞춤형 조명 시스템 잎 아닌 루트 (도 1)을 조명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
광 시트 형광 현미경 낮은 광독성 및 생리 상태에서 시료를 유지하면서, 높은 시공간 해상도의 대용량을 캡처하는 데 사용할 수있는 초고속 수집 속도를 결합하는 큰 장점을 갖는다. 밝은 장 현미경의 분해능은 공 초점 현미경 (9)의 것과 비교할 수있다. 그러나, 빛의 산란 및 흡수 개별적으로 여기 및 방출 경로를 따라 발생하여 전체 이미지 품질은 표면에 비해 불투명 조직 내부 상당히 낮을 수있다. 이러한 복잡화를 회피 한 세로축 샘플을 회전시키고 다른 방향에서 같은 부피를 관찰 할 가능성을 사용할 수있다. 그러나 이것은 예를 들어, 측면 뿌리는 더 많은 정보를 얻고없이 낮은 화질 결과 뒤에서 루트 및 이미지의 한면에 등장, 항상 유리하지 않다. 그러나, 회전은 주로 SAMP를 정확히 위치 시키는데 사용될 수있다가장 좋은 방법으로 제작. 대물 렌즈의 고전적인 수평 배열은 샘플 장착의 새로운 방법을 수 있습니다. 식물은 수직 위치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 장착 방법은 "겔의 표면 상에", 여기서 제시하는 등의 겔 (24, 25) 내부에 루트를 내장 등의 다른 실장 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 1) 루트 시스템은 액체 매체와 직접 접촉한다. 샘플 챔버 연속적으로 새로운 배지를 제공하는 관류 시스템에 연결된다. 또한 신속하게 다른 미디어 또는 약물을 적용하는 샘플 챔버의 전체 부피를 교환 할 수있다. 그들은 실험실에서 성장하는 데 사용되므로 2) 이전에 준비 식물 성장 샘플링합니다. 식물은 형광 현미경으로 선택할 수 있으며, 단지 원하는 식물을 제조 할 필요가있다. 3) 식물이 접촉되지 않고 시료 홀더 페트리 접시에서 전송된다. 이에 따라 식물은 또한 그것이 성장에 incubato에서 성장 된 동일한 겔 개발할 수R 및 기계적 응력은 최소로 감소된다. 4) 검체의 도면 탁하고 시료와 검출 목적의 간격만으로 중간 굴절율과 서로 다른 다른 물질로 채워져 있기 때문에 광학 수차를 최소화된다.
장기간의 촬상을 수행하기 위해, 식물 조명 시스템은 식물의 광합성 활성을 보장하기 위해 필요하다. 대부분의 실험실에서 식물은 투명한 겔상에서 성장 뿌리가 빛에 노출되는, 즉. 이것은 그들의 환경에 서로 다른 반응을 일으킬 및 생화학 및 개발 (26, 27)의 변화를 유도 할 수있다. 루트 시스템에서 빛의 양을 줄이기 위해, 흑색 플라스틱 호는 물 표면과 블랙 알루미늄 박으로 이루어지는 뚜껑 샘플 챔버를 포함을 커버하는데 사용되었다. 식물에 도달 할 수 빛 뚜껑의 중앙 구멍을 통해 나뭇잎. 이 설정에서 배경 빛의 증가는 suggestin를 관찰되지 않았다적색 및 청색 LED로부터의 미광의 양이 크게 GFP 필터 및 차광 방식으로 감소 하였다 g. 그러면 카메라 배경 노이즈를 증가시키지 않고, 화상 취득 동안에 온 광을 유지시켰다.
샘플 홀더는 3D 프린팅을 위해 설계되었습니다. 시험 하였다 여러 플라스틱 샘플의 드리프트 결과 100 % 안정하지만, 소재의 선택이 매우 중요하다. 따라서, 수지를 사용하는 대신 또는 폴리에틸렌 (PEP)로드를 분쇄하여 샘플 홀더를 구축 할 것을 권장한다. 양면 조명계와 광 시트 현미경 설정을 사용하는 경우 샘플 홀더는 상기 회전 각도에 따라 광 시트 중 하나를 방해 할. 플레이트에서 공장을 떠서 동안 기계적 스트레스를 줄이기 위해 주걱의 평평한 각도를 사용합니다. 이 공장은 빠르게 건조하고 아주 처음 경험 공기 흐름 수 있습니다. 우와, 어떤 공기 초안 (빠른 동작, 에어컨 흐름을)하지 않도록하십시오가능하면 RK는 중단없이하고 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 현미경 내부는 액체의 전체 공장을 찍어 마른 잎을 유지하지하기 위해 매우 중요합니다.
이 기술은 측면 루트 형성의 초기 단계의 촬상에 적합하다. 성숙한 뿌리 끝의 장기 이미징을 수행 할 때 하나는 애기 장대의 뿌리가 시야에서 빠른 속도로 100 ~ 300 μm의 / h로 성장할 것을 명심해야합니다. 매우 유용한 미래의 구현은 시간의 연장 기간 동안 다음과 같은 뿌리 끝의 성장을 허용하는 자동화 된 추적 알고리즘이 될 수 있습니다. 획득 프로세스 동안 이러한 빛의 영양 배지 조성 등의 환경 조건을 제어 할 수있는 능력은 식물 변화에 적응하는 방법을 조사 할 수있다. 루트 (28)는 유도 덱사메타손 또는 β-ESTR 등을 사용하여 화학적으로 유전자 발현을 활성화하는 약물을 적용 할 수있는 액체 매질과 직접 접촉유도 시스템 (29) adiol. 그러나, 약물을 씻어 샘플 챔버의 전체 볼륨을 교환하는 시간이 걸린다. 셋업 매체 교환을 촉진하기 위해 샘플 챔버의 체적을 최소화함으로써 개선 될 수있다. 그럼에도 불구하고,이 기술은 큰 잠재력을 가지고있다. 장착 순서, 표준 성장 조건 및 광 시트를 현미경을 사용하여 부드러운 이미지 획득의 결합은 생리적 수준의 고해상도 식물 개발 장기 연구를 허용한다. 이 식물 개발의 기본 메커니즘을 탐구하는 연구자 도움이 될 것입니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 오디오 장비에 대한 중요한 읽기 / 볼 MATYAS Fendrych와 스테판 Stadlbauer 감사합니다. OpenSPIM에 기여하기위한 IST 오스트리아에서 MIBA 기계 공장에 감사합니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 REA 보조금 협정 N ° [291734]와 유럽 연구위원회 (프로젝트 ERC 2011에서 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)의 인민 계획 (마리 퀴리 작업)에서 자금을받은 -StG-20101109-PSDP).
Materials
| Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
| Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
| Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
| LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
| LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
| LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
| MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
| Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
| Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |
Referenzen
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