유도 결합 플라즈마 - - 레이저 박리에 의한 뇌 조직의 이미징 금속 질량 분석 (LA-ICP-MS)

여기에 설명 된 절차는 하워드 월터 플로리 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리의 국립 보건 의료 연구위원회 표준을 준수하고 있습니다. 분석을위한 시료의 1. 준비 참고 :이 단계는 분석 할 시료 매트릭스에 따라 달라집니다. 샘플 준비와 절편 주 : 고정 0.1 M PBS로 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 30 %의 수크로오스에 cryoprotection을 사용하여 조직으로부터의 금속의 침출 량의 변화가 발생할 것이다. 특정 자세한 내용은 토끼 등의 알 (19)을 참조하십시오. 확인 모든 샘플은 동일한 고정 및 cryoprotection 단계를 겪었다. 로 transcardially 얼음처럼 차가운 0.1 M PBS, pH를 7.4로 안락사 동물 (Dodt 등. 자세한 내용은 (20)의 방법 섹션을 참조)를 관류 뇌를 제거합니다. 조직을 해결하기 위해 4 % PFA O / N에서 뇌를 놓습니다. <리> Cryoprotect는 24 시간 동안 0.1 M PBS 30 % 수크로오스에 배치하고, 뇌에 의한 또 다른 24 시간 동안 신선한 30 % 수크로오스로 변경. (19) 적어도 1 시간 동안 -20 ℃에서 저온 유지 장치에서 뇌를 고정. 적합한 설치 매체를 사용하여 척에 두뇌를 탑재합니다. 제 금속이없는 일회용 블레이드를 사용하여 저온 유지 장치에 뇌 (예를 들어, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 [PTFE는] 칼 – 코팅) 및 표준 현미경 슬라이드에 탑재합니다. 섹션에 대한 최적의 두께는 약 30 μm의 수 있어야합니다. 원하는 두께로 파라핀 포함 된 샘플 섹션을 사용하는 경우, 따뜻한 물을 욕조에 리본을 떠 표준 현미경 슬라이드에 탑재합니다. 참고 : 장기 고정 및 생체 시료의 파라핀 삽입의 정확한 효과는 알려져 있지 않다. 1.1에서 설명한 바와 같이, 비교 분석이 의도하는 경우 모든 샘플이 동일한 샘플 준비 절차를 거친 보장합니다. 왁스 제거 PA자일 렌의 3 변경 한 변화 각의에서 슬라이드를 찍기로 RAFFIN 내장 샘플 : 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 ISO 3696 또는 이하 동등 정제수 (3 변경의 최소 '로 지칭 물 ';. 자세한 방법에 대한 토끼 등 21 참조). 에 샘플을 허용 공기 건조와 같은 랙에 수직으로 배치 된 샘플 슬라이드 상자와 열려 왼쪽 덮개로 먼지가없는 환경에서 약 1 시간 동안. 매트릭스 일치 표준 2. 준비 주 : 다음은 이전 9 출판 요약 프로토콜입니다. 매트릭스 일치하는 조직 표준을 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 원래 종이를 참조하십시오. 상업 어린 양의 머리를 얻습니다 (또는 유사) 모든 혈액과 결합 조직을 제거, 물에 헹군다. 메스를 사용하여 조심스럽게 대뇌 피질의 tissu의 약 50 g의 해부전자 부분적으로는 낮은 전력의 폴리 카보네이트 일회용 프로브와 휴대용 조직 균질를 사용하여 균질화. 수가 보정 범위 및 원하는 교정 포인트의 수에 따라 함께 5 그램 분취 량으로 나눈다. 각 검체의 수용성 염 (예를 들면, 다음날에 FeSO4를 · H 2 O) 1 % 질산 0.1, 1, 100 mg의 금속 용액 -1 축적량을 제조 용해 각 표준 스파이크 금속 용액을 준비한다. 에서 아군 금속 농도 범위를 달성하기 위해 (10 μg의 g -1 웨트 티슈의 근사 최종 농도 예 5 μL 10 밀리그램 mL의 1) 5 g 분취 티슈 원액의 미리 계산 된 양을 추가 각각의 표준입니다. 각 표준의 원하는 최종 농도에 따라, 표준 첨가 용액의 최소량을 보장하기 위해 각 금속 원액의 조합을 사용한다. 동등을 보장하기 위해 각 표준 물의 최종 스파이크 추가첨가 액 가의 볼륨은 각 규격에 존재한다. 약 30 초 동안 낮은 전력의 아군 기준을 균질화. 즉시 사용하지 않으면, 파라 필름으로 밀봉 캡핑 된 폴리 프로필렌 튜브에서 -20 ° C에 냉동 보관. 정확한 농도와 다음 절차 중 하나를 사용하여 각 표준의 동질성을 확인합니다 : 전자 레인지 소화 세척 된 PTFE 분해 용기의 표준 6 정확하게 칭량 (약 50 mg)을 분취 배치 농축 4 mL의 65 % 질산과 30 % 과산화수소 1 mL를 넣어. 밀폐하고 30 분 동안 500 W에서 다이제스트. 정량적 흄 후드에서 소화 용기, 개방을 냉각 한 후 물 10 ㎖ 씩을 사용하여 산 세척 50ml의 튜브에 소화 솔루션을 전송합니다. 약 50ml로 확인하고, 정확하게 최종 용액의 중량을 단다. 각 표준에 대한 2.5.1.2 – 반복 2.5.1.1 단계를 반복합니다. 전자 레인지 소화 장비를 사용할 수없는 경우 다음 절차를 사용 : 산 세척 / 금속 – 무료 폴리 프로필렌 튜브와 동결 건조 된 O / N로 표준의 분취 – 여섯 정확하게 측정 (200 mg의 25 사이)을 놓습니다. 5 분 동안 70 ° C까지 가열 블록, 농축 질산, 열, 캡핑 40 μL를 추가 한 다음 30 % 과산화수소 10 μL를 추가한다. 추가로 5 분 동안 가열 한 후 정확하게 1 % 질산의 950 μL를 사용하여 1 mL의 총 부피 할 수 있습니다. 참고 : 그것은 소화 절차의 정확성을 보장하기 위해 선택의 방법을 사용하여 인증 표준 물질을 소화하는 것이 좋습니다. 표준 프로토콜을 사용하여 용액의 분무 ICP-MS에 의해 각각의 소화 용액 중의 금속 농도를 결정한다. 각 분취 량의 상대 표준 편차 (%의 RSD)를 결정하여, 각 기준의 균질성을 평가. % RSDS 15 % 내의 모든 가을을 확인합니다. EA의 질량 측정을 이용하여CH 분취 각 균질 조직 표준의 정밀 금속 농도를 계산한다. 균질 조직 표준에 복귀하는 5 × 5mm 플라스틱 일회용 조직학 금형 팩과 이소 펜탄에 냉동 액체 질소로 냉각시켰다. 샘플과 동일한 두께로 저온 유지 장치의 금형 및 섹션의 냉동 표준 조직 블록을 제거합니다. 참고 : 미래 실험에 두께를 변화에서 섹션의 수를 준비하는 것이 좋습니다. 공기 – 건조 기준 기밀 먼지없는 용기에 무기한 저장 될 수있다. 분석을위한 LA-ICP-MS 3. 준비 절제 챔버 찾는 표준 시료는 그들이 LA 유닛에 장착 된 CCD 카메라의 피사계 심도 내에 있다는 것을 보장한다. 악기의 튜닝이 필요한 경우 (예를 들어, 유리의 NIST (612) 추적 요소) 적절한 참고 자료를 포함한다. 제 밀봉 챔버 도어에있는 두 개의 나사를 손가락으로 조E 절제 챔버. ICP-MS 소프트웨어에서, '유지 보수'또는 유사한 패널 오픈 아르곤 가스 밸브를 선택하고 해당 대화 상자 분 -1 1.2 L에 캐리어 가스의 흐름을 설정한다. 주 :이 프로토콜 아르곤 캐리어 가스로서 사용된다. 몇몇 예로는 헬륨 캐리어 가스로서 헬륨과 아르곤의 혼합물 중 하나를 사용한다. 에어로졸 캐리어 가스로 헬륨과 아르곤의 혼합물을 사용하기위한 기술적 인 세부 사항에 대한 귄터와 하인리히 (22)을 참조하십시오. 라 소프트웨어에서 30 분의 최소 아르곤 가스로 셀을 세척하기 위해 '제거'버튼을 클릭합니다. 참고 : 퍼지 시간은 '퍼지 시간'또는 이와 유사한 버튼을 클릭하여 변경할 수 있습니다. 두 볼륨 절제 셀 절제 시스템을 사용하는 경우 주기적으로 각 코너 스테이지 이동 대각선만큼 잔류 공기가 가능한 셀에서 제거되도록하여 셀을 통과. 이는 '홈 단계'또는 당량을 선택함으로써 달성 될 수있다alent 기능. '에 플라즈마'를 클릭하여 ICP-MS를 켜고 3.5 단계 동안 두 시간 동안 예열 할 수 – 4.4이 수행 될 수있다. 적절한 LA-ICP-MS의 운전 조건의 일례는 토끼 등에서 발견 될 수 있지만 악기 설정 제조사마다 다를. 10. 조직 표준 주제 절제 선 도구를 선택하고 조직의 표면을 가로 질러 약 3 mm 길이 절제 한 줄을 그립니다. (스캔 속도의 4 배 빔 직경, 빔 (30 μm의 빔 여기에 사용되는 사용자에 의해 적절하게 선택) 직경 : 실험 목록에서 절제의 선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다음을 변경하여 다음과 같이 매개 변수를 설정 초당 -1 120 μm의들) 및 에너지 플루 언스 (0.3 -0.5 J의 cm -2 부드러운 조직을 위해) 열심히 행렬을 위해 필요한 경우 최적화 할 수 있습니다. 30 ㎛의 두께로 조직 레이저 빔은 전체 thic 침투하지현미경 지원에서 잠재적 인 오염 물질을 제거하는이 조직의 kness. 탄소 (23)는 정규화 절제된 조직의 양의 변동을 보정하기 위해 사용될 수있다. '기본'라디오 버튼을 선택하여 이후의 각 라인에 대한 기본값으로 이러한 매개 변수를 설정합니다. 초기 줄을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭을 선택하고 '중복 검사'를 선택하여이 줄을 여섯 번 중복. 빔 직경에 의해 또는 Y- 축 – 확인 라인 중 하나에있는 X를 오프셋합니다. 이 표준에 따라 일곱 라인 전체를 제공 빔 직경에 따른 이격. 동일한 길이의 라인을 확보, 각 표준 3.5.3 – 반복 3.5.1 단계를 반복합니다. 다음 두 가지 방법 중 하나를 따르 샘플을 통해 절제 영역을 그리려면 : 참고 : 동일한 스캔 파라미터 (빔 직경, 스캔 속도, 에너지 플루 언스를) 확인 샘플 라인에 사용된다. 라 시스템은 장착되어있는 경우보기의 넓은 필드, 라인 도구를 선택하고 3.5에 설명 된 같은 레이저 매개 변수를 사용하여 가장 넓은 부분에서 샘플을 커버하기에 충분히 긴 샘플의 왼쪽 상단 모서리에서 선을 그립니다. 필요에 따라 여러 번 샘플의 전체 범위를 보장하도록 빔 직경에 따라 간격 라인 3.5.3에 설명 된대로이 검사를 중복. 다양한보기 필드를 사용할 수없는 경우를 결정하고, X 및 Y 좌표를 기록 전체 샘플을 덮는 직사각형의 모서리에 대응하는 (전형적으로 '스테이지 위치'또는 유사한 같이 메인 화면의 표시). 3.7.1에 설명 된대로 전체 샘플 영역을 다루는 절제의 평행선의 위치를이 좌표를 사용합니다. ~ 3.5에 기재된 절차를 반복하여 샘플을 주사 한 후 20 시간이 늦어도 표준의 간헐적 스캔 선을 그릴. 이것은 여러 번 요구 될 수있는 샘플의 주사 기간에 따라. ADDI으로 실험을 종료표준의적인 검사. 주 : 셀이 홈 포지션을 선택 퍼징하고 축 연관된 캘리브레이션 변경 반면 x 및 y 좌표를 결정할 때, 이전의 차이 반면 X의 특성 및 Y 좌표를 획득 (즉, 선 길이가됩니다) 영향을받지. 4. ICP-MS에 대한 데이터 수집 방법 설정 박리의 표준 라인, 한 줄의 총 분석 시간을 결정하기 위해, 레이저의 주사 속도에 의해 라인의 길이를 나눈다. 샘플 라인에 대해이 작업을 반복합니다. ICP-MS 소프트웨어에서 (A '배치'로 여기에 표시) 새로운 방법을 만들어 '시간 분석을 해결'또는 이와 동등한이 선택되어 있는지 확인합니다. 제 m / z 값이 검출 될 선택한 1 사이클 동안 총 통합 시간은 0.25 S와 동일하도록 각각의 m / z에 대한 적분 시간을 조정한다. 클릭하여 '다른 이름으로 저장 박쥐이에 따라 채널로 '이름 (예를 들어, STD1). 주 : 샘플 4 번 빔 직경의 레이저 빔을 통과하는 바와 같이, 이것은 각각의 질량에 대한 데이터 점은 상기 빔 직경 (12)에 상당 기록 보장한다. 예를 들어, 진정한 픽셀 크기의 이미지를 생성한다 0.25 (S)의 적분 시간을 100㎛의 스폿 크기 400 ㎛의 s의 스캔 속도를 사용 -1. 통합 시간은 감도를 향상시키기 위해 조정될 수있다; 0.33 s의 스캔 속도를 적분 시간이 증가 할 때 세 번 빔 직경 둔화한다. 표준의 경우, 해당 상자의 각 라인 스캔의 분석 시간을 입력, 플러스 추가로 15의 레이저 예열 및 세척 시간을 고려하여. 샘플 실행 목록 입력 인수 동일한 수 (일반적으로 순차적으로 번호, 즉 001, 002, 등) (스캔이 실행되는 순서 IE) 표준 라인의 총 수있다. 샘플에 대한샘플을 어블 레이션 할 라인 수에 맞게 (추가의 15 초 포함)의 총 획득 시간 및 인수의 수를 다른 파일 이름으로 현재의 방법 또는 일괄 저장하여 표준에 사용 된 방법을 복제하고, 조정 . 주 : 대부분의 LA-ICP-MS 시스템은 단방향 트리거 (LA는 ICP-MS를 트리거)를 사용할 때,는 ICP-MS 소프트웨어 절제 개시의 후속 행하기 전에 LA에서 트리거를 기다리는 것이 필요하다. ICP-MS 획득 창 '시작을 기다리고'읽습니다. 5. 실험 실행하기 큐에 첫 번째 방법 또는 일괄 처리를 추가하여 ICP-MS 큐를 시작하고 소프트웨어가 LA 시스템에서 트리거를 기다리고되어 있는지 확인합니다. 라 소프트웨어에서, '방출'을 클릭하여 레이저 전원 공급 장치를 사용 '실행'을 클릭하고 해당 상자에 20 초에 레이저 예열 10 초에 시간과 세척 시간을 설정합니다. 참고 :이 오버런이됩니다레이저 절제의 각 후속 라인을 개시 할 때 ICP-MS는 새로운 데이터를 획득 시작할 준비가되어 있음을 확인합니다. '시작'을 클릭하여 레이저 시퀀스를 시작합니다. 두 볼륨 셀을 사용하는 경우, 샘플 컵 위치에 있는지 확인하십시오. 6. 정량 표준을 계산 참고 : 이미지로 ICP-MS 데이터를 변환하기위한 여러 변화가 있습니다. 이러한 오픈 소스 언어 17, 24, 25, 26 및 상업적 매크로의 데이터 분석 소프트웨어로 작성된 수제 소프트웨어 도구의 사용을 포함한다. (7) 여기서, 전문 LA-ICP-MS 데이터 분석 제품군 (28)에 따라 (폴 등. 27에서 설명) 최근에 개발 된 소프트웨어 플러그인을 사용합니다. A를 실행 데이터 (001.d, 002.d, 등.)가 포함 된 모든 배치 폴더에 이동설치된 분석 소프트웨어와 별도의 컴퓨터. 별도의 폴더에 배치의 각 라인에 대한 *의 .CSV 데이터 파일의 압축을 풉니 다. 참고 : 자동으로 새 폴더에 * .CSV 파일을 전송하는 스크립트를 사용하여 매우 좋습니다. 자세한 내용은 첨부 된 파이썬 코드를 참조하십시오. 이 스크립트는 어느 애질런트 7700 또는 8800 시리즈 ICP-MS에 맞게 기록되어 있지만, 다른 제조업체로부터의 출력 파일에 맞게 수정 될 수있다. 소프트웨어 플랫폼을 열고 가져 후술 정량적 이미지를 생성하기 위해 기준을 분석하기위한 탭 순차적 따른다. 첫 번째 표준 배치에서 데이터를 가져 오려면 '가져 오기 유형'에 대한 '파일 형식'에 대한 '애질런트 .CSV', '전체 폴더'를 선택하고 '날짜 형식은'컴퓨터 포맷과 동일한 지 확인합니다. '가져 오기'를 클릭 기준의 첫 번째 세트에 대한 .CSV – 파일이 들어있는 폴더를 선택하고 '기준선'탭으로 이동합니다. 기준빼기 '수입의 정보'를 선택하고 '계속'을 클릭하고 도구 모음의 기본 응용 프로그램 드롭 다운 메뉴에서 '자동 선택'탭 (명령 2)를 사용합니다. '모두 선택'과 통합 'Baseline_1'을 선택 클릭합니다. 두 번째 값이 '0'을 입력하여 데이터를 자르 (레이저 예열 시간에 해당) 각 스캔 라인의 첫 번째 10 초를 선택하려면 '(행의 지속 시간 – 10 초)을'을 ( '통합 추가'를 클릭 예를 들어, , 35의 스캔 라인,) 값을 '0'과 '25'을 입력합니다. 샘플 데이터를 선택하기 6.4에 설명 된대로 "자동 선택"탭을 사용할 수 있지만, 통합으로 'OUTPUT_1'를 선택한다. 시작과 각 표준 라인의 끝에서 자르기 데이터는 (35의 스캔 라인에 대한 예를 들어, 입력 값 '13'과 '4') 배경 신호를 제외합니다. possi에 의한 신호에 방울을 제외하려면표준의 상상력 구멍은 '샘플'탭에서 노이즈 비율 (예를 들어, C13 또는 P31)에 높은 신호 채널을 선택하는 그래프 영역의 왼쪽 상단에 '채널'을 클릭합니다. 신호의 날카로운 방울의 메모를 확인하고 그 샘플 내에서 정상 편차 아래에 충분히 낮은 CPS 값을 선택할 수 있지만 충분히 높지는 신호의 급격한 하락을 선택할 수 있습니다. 'DRS'탭을 클릭하고 '현재 데이터 감축 계획'에 대한 'Baseline_Subtract'를 선택합니다. '인덱스 채널'6.6에서 채널과 '낮은 신호를 마스킹 할 때 임계 값은 사용'에 대한 CPS 값을 선택합니다. ICP-MS에 레이저에서 신호 전송의 지연을 고려하여 '낮은 신호 후 / 전 트림 초'에 대한 값 <0.5 초를 삽입합니다. 낮은 신호 영역의 적절한 마스킹을 확인하려면 '샘플'탭을 다시 클릭하고 처리 (예., Fe56_CPS) 채널 추적을 선택합니다. 반복 및 CPS와 & #을 세분화39; 초는 필요한 경우 6.7에서와 같이 낮은 신호의 가치 후 / 전 트림합니다. '결과'탭을 클릭하고 기본 응용 프로그램 드롭 다운 메뉴에서 '데이터 내보내기'를 선택합니다. 결과의 스프레드 시트 데이터 파일 (예 STD1 계산, STD2을 …)를 생성하기 위해 파일 이름을 입력한다. 적합한 스프레드 시트 프로그램에서의 데이터 파일을 열고 각 채널 정량 할 CPS에 대한 값을 계산한다. 각각 정량 요소 (μg의의 g-1) ppm으로 CPS 값으로부터 변환 계수를 계산하는 용액 분무 ICP-MS로부터 소정의 금속 농도를 사용한다. 실행에 표준의 모든 세트에 6.10 – 반복 6.3 단계를 반복합니다. 7. 양이 이미지 구축 소프트웨어를 열어 명령 프롬프트에서 'Biolite을 ()'작성합니다. 수 fo .CSV-파일을 포함하는 '이미지로드'를 클릭하고 폴더를 선택하여 샘플 데이터를 가져 오기샘플 이미지 r에. 배경 보정 샘플에 대한 배경 보정을 적용 할 '기준선'탭을 클릭합니다. 인에서 (P31) 이미지가 화면에 메시지, 사각형 그리기 도구를 사용하여 배경의 일부 지역. 신호 / 플라즈마 드리프트의 이미지 전체지도가 가능한 한 많은 지역을 만듭니다 선택하면 이러한 교란 요인에서 적절한 보상을 보장합니다. 백그라운드 신호가 더 볼 수 있도록 그래프 편집 도구를 선택하려면 (위에 표시된 이미지의 왼쪽)과 오른쪽 이미지를 클릭합니다. '이미지 모양을 수정'큰 음의 값 (예 : -100,000)에 '= Z에서 첫 번째 색상'을 변경 선택합니다. '완료'를 클릭하여 진행합니다. CPS / ppm의 보정 계수의 테이블을 가지고 '표준'탭을 클릭합니다. 요소의 각 단계 6.10의 기준에서 계산 된 값을 입력합니다. 이 단계는 ICP-MS의 감도 편차를 보정하는 데 도움이 될 것입니다. '이동을 클릭! ' 각 요소 및 각 단계에 대한 이미지를 보유하고있는 '데이터'탭에서 열기 '데이터 브라우저'. 수출에 대한 이미지를 완성하려면 'StdCorrImages'폴더에서 원하는 이미지를 선택, 이미지 이름 (* _ppm)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'NewImage'을 클릭합니다. 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 원하는 색상 표와 색상 스케일을 선택하는 '이미지의 모양을 수정'열 이미지를. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '주석 추가'를 선택하여 이미지에 색 눈금을 추가합니다. 왼쪽 상단의 드롭 다운 메뉴에서 'ColorScale'을 선택하고 원하는 색상 스케일을 수정 탭을 사용합니다. 이미지를 내보내려면 해당 이미지가 선택되어 있는지 확인하고 '파일'탭으로 이동 클릭 '그래픽을 저장 …'. 원하는 형식을 선택하고 이미지를 저장합니다. 또한, 선택한 이미지는 복사 및 붙여 넣기 도구를 사용하여 전송할 수 있습니다. 반복 관심의 모든 이미지 7.6 및 7.7 단계를 반복합니다. Quantif잉 이산 지역 투자 수익 (ROI) 도구를 활성화하려면, '분석'탭 '패키지'로 이동하여 '이미지 처리'를 선택합니다. 원하는 이미지를 선택하고 '이미지'탭으로 이동 클릭 '투자 수익 (ROI)을 …'. '시작 ROI 무승부'를 클릭하고 샘플에 대한 관심의 영역을 선택하려면 그리기 도구를 사용합니다. 도면을 마치려면 '마침 투자 수익 (ROI)'을 클릭합니다. 선택된 ROI에 대한 통계를 확보하기 위해, '이미지'탭으로 이동 클릭 '통계를 …'. 복사 별도의 스프레드 시트에 결과를 붙여 넣습니다. 모든 지역과 관심의 요소를 반복 ROI 선택 (7.9.2).