المعادن التصوير في أنسجة المخ عن طريق الاستئصال بالليزر - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي (LA-ICP-MS)
Summary
رسم كميا المعادن في الأنسجة عن طريق الاستئصال بالليزر – بالحث البلازما جانب – قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) هو تقنية تحليلية حساسة يمكن أن تقدم نظرة جديدة في كيفية المشاركة المعادن في العمليات وظيفة والمرض العادية. هنا، نحن تصف بروتوكول لتصوير كميا المعادن في أقسام رقيقة من الأنسجة العصبية الماوس.
Abstract
تم العثور على المعادن بتواجد مطلق في جميع أنحاء كائن حي، مع دور البيولوجي على تمليها كل من التفاعل الكيميائي وفرة في منطقة تشريحية محددة. داخل الدماغ، والمعادن لديها توزيع مجزأة للغاية، اعتمادا على وظيفتها الأساسية يلعبون داخل الجهاز العصبي المركزي. تصوير التوزيع المكاني للمعادن قدمت نظرة فريدة في العمارة الحيوية في الدماغ، مما يسمح علاقة مباشرة بين المناطق تشريحي عصبي وظيفة معروفة لها فيما يتعلق بعمليات تعتمد على المعادن. وبالإضافة إلى ذلك، تتميز العديد من الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر عطلت توازن المعادن، والتي غالبا ما يقتصر على مناطق صغيرة من الدماغ التي يصعب تحليلها على خلاف ذلك. هنا، نحن تصف طريقة شامل لتصوير كميا المعادن في مخ الفأر، وذلك باستخدام الاستئصال بالليزر – إضافة بالحث البلازما – قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) ومعالجة الصور المصممة خصيصاالبرمجيات. التركيز على الحديد والنحاس والزنك، والتي هي ثلاثة من المعادن الأكثر وفرة والأمراض ذات الصلة داخل الدماغ، وصفنا الخطوات الأساسية في إعداد العينات والتحليل والقياسات الكمية ومعالجة الصور لإنتاج خرائط توزيع المعادن داخل ميكرومتر منخفضة قرار مجموعة. هذه التقنية، التي تنطبق على أي مقطع قطع الأنسجة، وقادر على إثبات توزيع متغير بدرجة كبيرة من المعادن داخل الجهاز أو النظام، ويمكن استخدامها لتحديد التغيرات في توازن المعادن والمستويات المطلقة داخل الهياكل التشريحية الدقيقة.
Introduction
الأكسدة كيمياء فريدة من نوعها من المعادن يسهل مجموعة من الوظائف العصبية، بما في ذلك نقل الإشارة وإنتاج الطاقة والتوليف العصبي. في عدد من الأمراض العصبية الكبرى، كانت dyshomeostasis من هذه المعادن على حد سواء المتورطين في التسبب بالمرض وحددت أهدافا جديدة محتملة للتدخل العلاجي 1. لفهم أفضل لكيفية يشاركون المعادن في حالات مثل مرض الزهايمر والشلل الرعاش (AD وPD، على التوالي)، لا بد أن تكون قادرة على قياس مدى تغير توزيع المعادن والمستويات داخل المناطق المتضررة من عملية المرض. هذه التغيرات غالبا ما تكون مؤشرا على تحولات خفية في التفاعلات الكيميائية الحيوية التي قد تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا العمليات التي تبدأ موت الخلايا، مثل لدينا الآلية المقترحة مؤخرا من الحديد والدوبامين العصبية في PD 2.
تقليديا، ميتاوقد أمكن تحقيق مستويات لتر داخل المناطق التشريحية المحددة من خلال الاستئصال الدقيق، والهضم والتحليل باستخدام مجموعة من التقنيات التحليلية 3. ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج يفقد المعلومات المكانية، التي يمكن أن تكون حاسمة عندما الحالات المرضية يجري التحقيق إشراك صغيرة، مناطق محددة جيدا أو أنواع معينة من الخلايا. تتوفر لتصور المعادن في النظم البيولوجية، من عينات سليمة لقطاعات النسيج وثنائية وثلاثية الأبعاد، باستخدام التحليل الطيفي الانبعاثات، تحقيقات الفلورسنت وقياس الطيف الكتلي 4 وهناك عدد من الأساليب التحليلية. كل تقنية لها مزايا وعيوب تتعلق الحساسية والانتقائية من الأنواع الكيميائية، والقرار المكانية التي يمكن تحقيقها. لمحة شاملة عن مجموعة من التقنيات المتاحة، راجع مراجعة من قبل هير وآخرون. 5.
القائم على قياس الطيف الكتلي (MS) طرق هي الأكثر حساسية من هذه التقنيات، قادرة على قياس المعادن الأكثر أهمية من الناحية البيولوجية في تركيز أصلي بهم 6. ليزر الاجتثاث – إضافة بالحث البلازما – قياس الطيف الكتلي (LA-ICP-MS) التصوير يستخدم شعاع ليزر الأشعة فوق البنفسجية تركيزا تتراوح في حجمها من 1 إلى> 100 ميكرون في القطر (أو العرض، عند استخدام شكل شعاع رباعي)، والتي بموجبها يتم تمرير العينة 7. لا يمكن أن يتحقق من المعلومات الكمية من خلال الاجتثاث تمثيلي من المواد المرجعية القياسية، والتي يمكن أن يتم إنتاجها باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب المختلفة 8، كل منها بدرجات متفاوتة من الصعوبة التقنية والعملية التحليلية. يستخدم النهج الأكثر شيوعا مصفوفة المطابقة، حيث تعد المعيار مع التركيب الكيميائي الغالب مماثلة لتلك العينة من قبل ارتفاعه مع الحليلة الهدف وبدقة تقييم للتجانس وتركيز المعادن المطلق عن طريق تحليلية مستقلة 9، </suص> 10. ويمكن بعد ذلك الاجتثاث المعايير مستعدة أن تستخدم لأغراض المعايرة الخارجية، مما يسمح البيانات تركيز من صورة العينة الناتجة سيتم استخراج لكل بكسل.
يتم تحديد دقة وضوح الصورة من قبل كل من حجم الحزم والسرعة التي يتم مسحها ضوئيا العينة. معيار رباعي تصميم ICP-MS (والتي تمثل أكثر من 90٪ من جميع النظم ICP-MS المثبتة في جميع أنحاء العالم 11) هو محلل كتلة متسلسل، في تلك الدورات للكشف عن كتلة من خلال تحديد كافة نسبة الكتلة للشحنة (م / ض ) بدلا من جمع البيانات في وقت واحد. وهكذا، فإن اكتساب الوقت في كل دورة من الجماهير يجب أن تساوي إلى الوقت الذي يستغرقه لعينة لاجتياز عرض واحد من شعاع الليزر لضمان الحصول ممثل بكسل القرار المطلوب 12. الليزر اختيار حجم شعاع معلمة الحاسمة التي لها آثار كبيرة على كل من حساسية والزمن الكلي للتحليل. كما physi الاستئصال بالليزرساتيا يزيل المواد التي اجتاحت لICP-MS بواسطة غاز الأرجون الناقل، وكمية المادة التي يمكن الكشف عنها جسديا من قبل محلل كتلة يتبع قانون التربيع العكسي. على سبيل المثال، والحد من شعاع الليزر قطرها 50-25 ميكرون النتائج في الحد من المواد ذاب من قبل عامل من أربعة. بالإضافة إلى ذلك، كوسيلة من وسائل المسح الضوئي، وبأقطار شعاع أصغر زيادة الزمن اللازم لاجتثاث مساحة محددة. لذلك، التصميم التجريبي ضروري لتحقيق التوازن في القرار المكانية اللازمة مع احتياجات الحساسية وضيق الوقت.
وقد تم تطبيق التصوير بواسطة LA-ICP-MS إلى مجموعة من العينات، المصفوفات والحالات المرضية، بما في ذلك نماذج حيوانية من الاضطرابات العصبية 13، 14، صدمة إصابات الدماغ 15، توزيع، تعرض الأدوية المضادة للسرطان 16 المحتوية على معادن سامة في المشيمة 17 والمعادن تنقيبibution في الأسنان والعلامات البيولوجية من التحولات الغذائية في مستهل حياتها. 18 في هذا البروتوكول وصفنا طريقة عامة لتصوير الحديد والنحاس والزنك في مخ الفأر WT بدرجة وضوح 30 ميكرون، على الرغم من أنه يمكن أن تتكيف بسهولة مع مجموعة واسعة من أنواع العينات والنتائج التجريبية، استنادا إلى احتياجات المحلل.
Protocol
Representative Results
Discussion
المعادن التصوير في الأنسجة العصبية هي مجرد مثال واحد عن كيفية هذا البروتوكول يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن التوزيع وكميات من المعادن في أي مصفوفة البيولوجية. على الرغم من أن إعداد مواد مرجعية معيارية يمكن أن يكون شاقا، هو التجربة التي لا يمكن أن يؤديها مرة واحدة وحفظها لاستخدامها لاحقا.
LA-ICP-MS لديها بعض المزايا على طرق بديلة، مثل القائم على السنكروترون الأشعة السينية مضان المجهر، ومعظمهم من حيث سهولة الوصول والحساسية. ومع ذلك، هناك بعض العيوب التي يجب أخذها في الاعتبار عند إعداد التجربة باستخدام LA-ICP-MS، وعلى هذا النحو هو في كثير من الأحيان تقنية تكميلية مفيدة للتصوير الكيميائية التي تشمل تقنيات تحليل المعادن البديلة، فضلا عن الكيمياء النسيجية المقارن 5.
التوافق مع الخصائص التشريحية المعروفة للدماغ الفأر يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن relati وظيفي ممكنonship بين مستويات المعادن والتوزيع المكاني. سابقا، وقد استخدمنا ألين الدماغ أطلس الموارد على شبكة الإنترنت، 29 وهو مستودع الوصول المفتوح من كلا البيانات التعبير التشريحية والجينات في مخ الفأر C57BL / 6 لدراسة الارتباط المكاني من كلا التعبير انزيم التي تعتمد على المعادن 14 والتشريح 27، 30. الموارد الأخرى، مثل منضدة القوارض الدماغ 31 متوفرة للمساعدة في التسجيل والمواءمة بين الصور المعادن للمساعدة في تحديد الصحيح من توزيع المعادن في المناطق التشريحية غالبا ما تكون صغيرة أيضا.
تطبيقات هذه التقنية مفيدة في تقييم مستويات كيف معدنية وتغير التوزيع في الميكروسكيل في جميع أنحاء كل أحداث الحياة العادية (على سبيل المثال، الشيخوخة) وفي الحالات المرضية. وكذلك دراسة تأثير كل من المركبات المحتوية على المعادن والأدوية المصممة لاستهداف ليتل الأيض. القيود الرئيسية الحالية للLA-ICP-MS باعتبارها تقنية التصوير لتقييم مكانيا توزيع المعادن والإنتاجية والحساسية. هناك علاقة تبادلية بين سرعة التحليل والقرار المكانية 5، 12، مع صور عالية الدقة تتطلب الأوقات تحليل أطول. هذه التقنية هي مناسبة تماما لعناصر بيولوجية في تركيزات أعلى، على الرغم من تقييد العناصر مثل المنغنيز والكوبالت والسيلينيوم وذلك بسبب وفرة منخفضة في الأنسجة الطبيعية و / أو القيود في الكشف عنها من قبل التقليدي ICP-MS. التطورات الجديدة في مجال التكنولوجيا ICP-MS، مثل إدخال تحليل كتلة الثلاثي رباعية، والسماح للكشف المستهدفة من التحاليل الصعبة، مثل السيلينيوم 32 في الحساسيات أعلى 33. كإجراء المعتمدة على التكنولوجيا، والتقدم في كل من ليزر وتصميم مطياف الكتلة سوف نرى هذا التصوير تقنية تستمر في التطور، وزيادةسرعة تحليل وحساسية 34.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمدة DJH وPAD من قبل مشروع المجلس الاسترالي للبحوث الربط (LP120200081) مع اجيلنت تكنولوجيز وESI المحدودة مساهمة BK كان مدعوما من جامعة الرور بحوث مدرسة PLUS، بتمويل من مبادرة التميز في ألمانيا [DFG GSC 98/3]. وقد DJH دعما جزئيا من قبل مؤسسة Ramaciotti. ويدعم KK من قبل مؤسسة سيجريد جوسيليوس.
Materials
| Soda glass microscope slides | n/a | n/a | Typical slides are suitable for all experiments |
| PTFE-coated microtome blades | C.L. Stuckey | DT315R50 | Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering. |
| Parafomaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Any supplier suitable |
| Sucrose | n/a | n/a | Commercial grade white sugar is suitable |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P5368 | Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 247624 | Any supplier suitable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Any supplier suitable |
| Lamb brain | n/a | n/a | Available from most local butchers |
| Metal salts | n/a | n/a | Use water soluble metal salts containing desired analytes |
| Omni TH Tissue Homogeniser | Omni Inc | THP115 | Alternative homogenizers are suitable |
| Polycarbonate homgenizer probes | Omni Inc | TH115-PCRH | |
| Microwave digestion unit | n/a | n/a | Optional. See Section 2 |
| 1.5 mL microfuge tubes | TechnoPlas | P4010 | Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable |
| 65% nitric acid | Merk Millipore | 100441 | Trace analysis grade |
| 30% hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 95321 | Trace analysis grade |
| 10 x 10 mm disposable cryomolds | Ted Pella | 27181 | |
| Iso-pentane | Sigma-Aldrich | 76871 | |
| Liquid nitrogen | n/a | n/a | Use local supplier |
| NWR213 Laser Ablation system | ESI Ltd | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Agilent 8800 Series ICP-MS | Agilent Technologies | n/a | Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol |
| Iolite | Iolite Software | n/a | Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol |
| Excel | Microsoft | n/a | |
| IGOR Pro | Wave Metrics | n/a | Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm |
Referenzen
- Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
- Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
- Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
- New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
- Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
- Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
- Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
- Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
- Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
- Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
- Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
- Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
- Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
- Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
- Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
- Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids – a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
- Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
- Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
- Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
- Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer’s disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
- Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
- Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
- Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis – An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
- Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
- Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
- Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
- Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
- Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
- Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma – tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements – a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
- Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).
