Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम nosocomial एंटीबायोटिक जुड़े दस्त के संक्रमण 1 के प्रमुख कारणों में से एक है। इस ग्राम पॉजिटिव अवायवीय जीवाणु मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से अपने बीजाणु फार्म के माध्यम से फैलता है। पिछले दशक में, नए '' महामारी '' या '' hypervirulent '' उपभेदों (जैसे बीआई / NAP1 / 027) उत्तरी अमेरिका और यूरोप में 2 नए संक्रमणों और मृत्यु दर में भारी वृद्धि के कारण होता है। सी बेलगाम -associated रोग (CDAD) उच्च मृत्यु दर 3 के साथ एक जीवन धमकी पेट के सूजन है। लक्षण दस्त 4 से 5 pseudomembranous कोलाइटिस और अक्सर घातक जहरीले मेगाकॉलोन 6 को लेकर।
CDAD का उपचार मुश्किल है के रूप में ज़हरीले उपभेदों बहुऔषध प्रतिरोधी रहे हैं और पुनरावृत्ति दर ऊंची 7 है। पल चिकित्सा एंटीबायोटिक दवाओं metronidazole, fidaxomicin या vancomycin, या repetiti में शामिलvely आवर्तक मामलों मल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण। नई चिकित्सकीय रणनीतियों तत्काल 8 की जरूरत है। कुछ प्रगति चिकित्सीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Bezlotoxumab रूप में दर्ज है, को निशाना सी बेलगाम विष बी 9, हाल ही में सफलतापूर्वक तीसरे चरण नैदानिक परीक्षण पारित किया है और एफडीए और ईएमए के साथ अनुमोदन के लिए दायर किया गया था। इसके अतिरिक्त, नई एंटीबायोटिक दवाओं के क्लिनिकल परीक्षण 10 के विभिन्न चरणों में इस समय परीक्षण किया जा रहा है।
प्रभावी उपचार नई चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान की जानी चाहिए विकसित करने के लिए। (; CD2830 / Zmp1; PPEP -1 ईसी 3.4.24.89) ने हाल ही में सी बेलगाम प्रोटीज प्रोलाइन प्रोलाइन endopeptidase -1 की खोज की इस तरह के एक होनहार लक्ष्य है, एक नाक आउट तनाव में PPEP -1 की कमी के रूप में सी की डाह कम हो जाती है । विवो 11 में बेलगाम। PPEP-1 एक secreted Metalloprotease 12,13 उनकी सी टर्मिनस पर दो सी बेलगाम adhesins cleaving है 13 इस प्रकार पक्षपाती Bacter रिहामानव आंत उपकला से आइए। इसलिए, यह सी बेलगाम के बिना डंठल और गतिशील phenotype के बीच संतुलन बनाए रखने में शामिल है। PPEP -1 के खिलाफ चयनात्मक अवरोधकों को विकसित करने और समझने के लिए कि यह कैसे अपनी substrates पहचानता अपने तीन आयामी संरचना के गहन ज्ञान अपरिहार्य है। हम एक सब्सट्रेट पेप्टाइड के साथ 14 PPEP -1 अकेले और परिसर में की पहली क्रिस्टल संरचना हल कर दिया है। PPEP -1 पहली ज्ञात प्रोटीज है कि दो प्रोलाइन अवशेषों 15 के बीच चुनिंदा cleaves पेप्टाइड बांडों। यह एक डबल kinked ढंग से सब्सट्रेट बांध और एस-पाश है कि प्रोटीज सक्रिय साइट 14 कवर में स्थित अवशेषों की एक विस्तारित स्निग्ध खुशबूदार नेटवर्क के माध्यम से इसे स्थिर। इस सब्सट्रेट बाध्यकारी मोड PPEP-1 के लिए अद्वितीय है और आज तक मानव proteases में नहीं मिला। यह यह एक आशाजनक दवा लक्ष्य बनाता है, और बंद लक्ष्य अवरोधकों बहुत संभावना नहीं के प्रभाव।
विकसित और स्क्रीन चयनात्मक PPEP -1 INH करने के लिएibitors भविष्य में शुद्ध और monodisperse PPEP -1 प्रोटीन की एक बड़ी राशि की जरूरत है। इसके अलावा, PPEP-1 के साथ पहली निरोधक, सह-क्रिस्टल संरचनाओं के बंधन से निर्धारित करना होगा की विधा निर्धारित करने के लिए। हमारे हाथ में PPEP -1 लगातार intergrown क्रिस्टल पैदा करता है। इस प्रकार हम एक अनुकूलन प्रक्रिया PPEP -1 के एकल विवर्तन गुणवत्ता वाले क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल में हम विस्तार से PPEP-1 14 के उत्पादन, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण और संरचना समाधान का वर्णन है। हम स्राव संकेत अनुक्रम, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी और शुद्धि टैग को हटाने के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी कमी एक PPEP -1 संस्करण की कोलाई में intracellular अभिव्यक्ति का उपयोग, जस्ता एकल तरंगदैर्ध्य विषम फैलाव के माध्यम से एक अनुकूलन स्क्रीन और संरचना निर्धारण में 16 microseeding द्वारा पीछा किया (जस्ता-एसएडी) 17। इस प्रोटोकॉल अन्य प्रोटीन के उत्पादन और संरचना निर्धारण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे </ Em> metalloproteases) और intergrown क्रिस्टल का उत्पादन प्रोटीन के लिए विशेष रूप से। अनुरोध पर, निर्माण की प्लास्मिड डीएनए (pET28a-Nhis-rPPEP -1) और विवर्तन डेटा शैक्षिक उद्देश्यों के लिए ही प्रदान की जा सकती है।
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अभी भी प्रोटीन 28 के तीन आयामी पास परमाणु संकल्प संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए सबसे तेज और सबसे सही तरीका है। हालांकि, यह भी आदेश दिया एकल क्रिस्टल के विकास की आवश्यकता है…
The authors have nothing to disclose.
हम विकिरण डेटा संग्रह के दौरान स्विस प्रकाश स्रोत, पॉल-शेर्रर-संस्थान, Villigen, स्विट्जरलैंड समर्थन के लिए कम से beamline X06DA पर कर्मचारियों को धन्यवाद। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मोनिका Gompert के आभारी हैं। परियोजना कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित और अनुदान जर्मन अनुसंधान परिषद से INST 216 / 682-1 FUGG था। सीपी को विकास स्वास्थ्य और रोग में इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल से पीएचडी फैलोशिप स्वीकार किया है। अनुसंधान इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुदान समझौते नं 283570 (BioStruct-एक्स) के तहत यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) से धन प्राप्त हुआ है।
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |