Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties ^1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe '' epidemie '' of '' hypervirulent '' stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa ^2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven ^3. De symptomen variëren van ⁴ tot diarree pseudomembraneuze colitis ⁵ en de vaak fatale toxisch megacolon ^6.

Behandeling van CDAD is moeilijk als de virulente stammen zijn multiresistente en de herhaling is hoog ^7. Momenteel therapie omvat antibiotica metronidazol, fidaxomicine of vancomycine, of repetititief terugkerende gevallen fecale microbiota transplantatie. Nieuwe therapeutische strategieën zijn dringend nodig ^8. Er is enige vooruitgang is geboekt als het therapeutische monoklonaal antilichaam Bezlotoxumab, gericht op C. difficile toxine B ^9, heeft onlangs met succes geslaagd voor fase III klinische studies en is ingediend voor goedkeuring bij de FDA en EMA. Daarnaast worden nieuwe antibiotica getest momenteel in verschillende stadia van klinische proeven ^10.

Om een ​​effectieve behandeling van nieuwe therapeutische doelen moeten worden geïdentificeerd ontwikkelen. De recent ontdekte C. difficile protease proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) is een dergelijk veelbelovend doelwit, het gebrek aan PPEP-1 in een knock-out stam vermindert virulentie van C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 is een uitgescheiden metalloprotease ^12,13 splitsen twee C. difficile adhesinen hun C-terminus ¹³ waardoor aldus de hechtende bacteria van de menselijke darm epitheel. Daarom wordt betrokken bij het handhaven van het evenwicht tussen de vastzittende en beweeglijke fenotype van C. difficile. Om selectieve remmers te ontwikkelen tegen PPEP-1 en te begrijpen hoe het haar substraten erkent intieme kennis van de driedimensionale structuur is onontbeerlijk. We hebben loste het eerste kristalstructuur van PPEP-1 alleen en in complex met een substraat peptide ^14. PPEP-1 is de eerste bekende protease dat selectief splitst peptidebindingen tussen twee prolineresten ^15. Het bindt het substraat in een dubbelblinde wijze geknikte en stabiliseert via langere alifatisch-aromatische netwerk van residuen in de S-lus die de protease actieve plaats ¹⁴ omvat. Dit substraat bindingsmodus uniek is PPEP-1 en niet in menselijke proteasen date. Dit maakt het een veelbelovende drug target, en off-target effecten van remmers zeer onwaarschijnlijk.

Het ontwikkelen en het scherm selectieve PPEP-1 inwibitors in de toekomst een grote hoeveelheid zuiver en monodisperse PPEP-1 eiwit nodig. Teneinde voorts de wijze van binding van eerste remmers, co-kristalstructuren met PPEP-1 te bepalen zullen bepalen. In onze handen PPEP-1 produceert voortdurend vergroeide kristallen. Aldus hebben we een optimalisatieprocedure enkelvoudige diffractie kwaliteit kristallen van PPEP-1 kunnen produceren. In dit protocol beschrijven we in detail de productie, zuivering, kristallisatie en structuur oplossing van PPEP-1 ^14. We maken gebruik van intracellulaire expressie in Escherichia coli van een PPEP-1 variant ontbreekt de secretie signaalsequentie, affiniteitschromatografie en size exclusion chromatografie met het verwijderen van de zuivering tag, gevolgd door microseeding ¹⁶ in een optimalisatie scherm en structuurbepaling via zink single-golflengte afwijkende dispersie (zink-SAD) ^17. Dit protocol kan worden aangepast voor productie en structuurbepaling van andere eiwitten (bv </ Em> metalloproteasen), en in het bijzonder voor de productie van eiwitten vergroeide kristallen. Op verzoek, plasmide-DNA van het construct (pET28a-NHis-rPPEP-1) en diffractie gegevens kunnen worden verstrekt voor educatieve doeleinden.