Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium difficile er en af de hyppigste årsager til nosokomielle antibiotikum-associeret diarré infektioner 1. Dette Gram-positive anaerobe bakterie overføres gennem sin sporen form via det fækale-oral vej. I det seneste årti, nye '' epidemi '' eller '' hypervirulente '' stammer (f.eks BI / NAP1 / 027) forårsagede en drastisk stigning i nye infektioner og dødelighed i Nordamerika og Europa 2. C. difficile-associeret sygdom (CDAD) er en livstruende kolon inflammation med høje dødelighed 3. Symptomerne spænder fra diarré 4 til pseudomembranøs colitis 5 og ofte fatal toksisk megacolon 6.
Behandling af CDAD er svært som de virulente stammer er multiresistent og fornyet er høj 7. I øjeblikket terapi omfatter antibiotika metronidazol, fidaxomicin eller vancomycin, eller i repetitiholdsvis tilbagevendende sager fækal mikrobiota transplantation. Nye terapeutiske strategier er et presserende behov 8. Visse fremskridt er registreret som den terapeutiske monoklonale antistof Bezlotoxumab, rettet mod C. difficile toksin B 9, har for nylig bestået kliniske fase III studier og blev indgivet til godkendelse hos FDA og EMA. Derudover er nye antibiotika, der testes i øjeblikket på forskellige stadier af kliniske forsøg 10.
At udvikle effektiv behandling skal identificeres nye terapeutiske mål. Den nyligt opdagede C. difficile protease prolin-prolin endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1, EF 3.4.24.89) er sådan en lovende mål, som den manglende PPEP-1 i en knock-out stammen reducerer virulens C . difficile in vivo 11. PPEP-1 er et secerneret metalloprotease 12,13 spaltning to C. difficile adhæsiner ved deres C-terminus 13 derved frigør det vedhængende Bacterbl.a. fra det menneskelige tarm epitel. Derfor er det involveret i at opretholde balancen mellem siddende og bevægelige fænotype af C. difficile. At udvikle selektive inhibitorer mod PPEP-1 og til at forstå, hvordan det anerkender sine substrater indgående kendskab til sin tredimensionelle struktur er uundværlig. Vi har løst den første krystalstruktur PPEP-1 alene og i kompleks med et substrat peptid 14. PPEP-1 er den første kendte protease der selektivt spalter peptidbindinger mellem to prolinrester 15. Det binder substratet i en dobbelt-bøjet måde og stabiliserer det via en udvidet alifatisk-aromatisk netværk af rester placeret i S-sløjfe, der omfatter protease aktive sted 14. Dette substrat-bindende tilstand er unik for PPEP-1 og ikke fundet i humane proteaser til dato. Dette gør det en lovende lægemiddel mål, og off-target effekter af inhibitorer meget usandsynlige.
At udvikle og skærm selektiv PPEP-1 inhibitors i fremtiden er behov for en stor mængde af ren og monodisperse PPEP-1 protein. Endvidere at bestemme tilstanden af binding af første inhibitorer, co-krystalstrukturer med PPEP-1 skal bestemmes. I vores hænder PPEP-1 konstant producerer sammenvoksede krystaller. Vi har således udviklet en optimering procedure til fremstilling af enkeltkædede diffraktion kvalitet krystaller af PPEP-1. I denne protokol vi beskriver i detaljer produktion, rensning, krystallisering og struktur løsning af PPEP-1 14. Vi bruger intracellulær ekspression i Escherichia coli af et PPEP-1-varianten mangler sekretionssignalsekvens, affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi med fjernelse af rensning tag, efterfulgt af mikropodning 16 ind en optimering skærm og strukturbestemmelse via zink enkelt bølgelængde anomale dispersion (zink-SAD) 17. Denne protokol kan tilpasses til produktion og strukturbestemmelse af andre proteiner (f.eks </ Em> metalloproteaser), særlig for proteiner producerer sammenvoksede krystaller. På anmodning, plasmid-DNA af konstruktionen (pET28a-NHis-rPPEP-1) og diffraktionsdata kan leveres til undervisningsformål.
Røntgenkrystallografi er stadig den hurtigste og mest præcise metode til bestemmelse af tredimensionale nær-atomare strukturer af proteiner 28 opløsning. Men det kræver, at væksten i velordnede enkelte krystaller. Disse er ofte vanskeligt at få og den krystallinske tilstand er kunstig. Men en sammenligning af proteinstrukturer bestemt ved røntgenkrystallografi med dem, som andre metoder, især NMR, viser generelt en meget god overensstemmelse. I tilfælde af PPEP-1, et NMR-struktur offentliggjort for …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker personalet på beamline X06DA på den schweiziske Light Source, Paul-Scherrer-Institut, Villigen, Schweiz til støtte under indsamlingen synkrotron data. Vi er taknemmelige for Monika Gompert for fremragende teknisk support. Projektet blev støttet af universitetet i Köln og giver INST 216 / 682-1 FUGG fra forskningsrådet tysk. Et ph.d.-stipendium fra den internationale Graduate School i Udvikling Sundhed og Sygdom til CP anerkendes. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) i forbindelse med tilskudsaftale nr 283.570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |