ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry
Summary
Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Abstract
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Introduction
多細胞生物の細胞は、細胞のユニークなグループに属する特定のセルのためのユニークなまたは少なくともいずれかであり得る多くの個々の特徴を持っています。偶数培養クローン化された細胞は、その多様な形態によって証明されるように、個々の特性を示します。また、細胞の個性は、それが分泌する製品に反映されています。ウイルス感染の場合、ウイルス粒子は、それらを生成する細胞からタンパク質を運ぶことができます。例えば、HIVのための多くの宿主細胞タンパク質は、ウイルスエンベロープに埋め込まれており、別の細胞によって生成されたウイルスは、これらの特性のタンパク質1、2または「細胞シグネチャー」を有していてもよいです。
でも感染することなく、細胞が周囲の媒体小細胞外ベシクル（電気自動車）への放出します。多くの場合、これらの小胞とその構造の生合成は、ウイルス、特にレトロウイルスのそれに似ています。近年では、それは明らかになってきました最初に、「血小板ダスト」3であると考えられた電気自動車では、細胞間コミュニケーションの重要な生理的なシステムを構成しています。一緒に細胞間コミュニケーションの二つの他のシステム、すなわち、細胞-細胞接触相互作用および放出される可溶性分子と、電気自動車は、正常な生理機能を調整し、ウイルス感染6,7を含む様々な病状4,5に変更されます。
両方の放出ウイルス粒子と細胞外小胞は非常に多様であるが、それらは、それらの個々の特性が失われたバルク分析によって主に特徴づけられます。それらの異なる表面抗原に基づいて細胞表現型フローサイトメトリーに類似した方法は、個々のウイルスおよびウイルス様粒子を特徴付けるために必要とされます。残念ながら、電気自動車や小さなビリオンは、標準的なフローのインサイトを使用して分析することができませんメトリ法は、それらがほとんどのサイトメーターをトリガするために依存している光散乱信号を生成するには小さすぎるからです。この制限を回避するために、蛍光トリガーを適用することができます。電気自動車またはビリオンを蛍光抗体で染色されている場合は、その類似した蛍光と同等の大きさの自由な抗体およびその凝集体と区別することは困難です。
最近、我々は、通常のフローサイトメーター8,9を使用して、個々の小粒子上の抗原の特徴付けを可能にするナノテクノロジーベースの高スループットの方法を開発しました。多様なアプリケーション10、11、12、13のために他のグループによって記載されているように、我々は、関心対象の免疫捕捉粒子へのMNPを使用します。しかし、私たちの新しい技術は、個々の具体の捕獲を可能にしますFICの目標は、フリーフローティング抗体からの干渉を受けることなく、光の散乱ではなく、トリガー蛍光を用いてフローサイトメトリーによりこれらの捕捉された粒子の表現型解析を行いました。この方法は、広い用途を有し、 インビボで細胞によって生成されたウイルス-および非ウイルス小粒子の抗原性組成物を特徴付けるために使用され、in vitroでの表面抗原に対する特異的な蛍光抗体の利用可能性を提供することができます。我々はすでにいくつかの生物学的問題を研究するためにこの技術を適用しています。
特に、我々は個々のHIV-1粒子9で宿主細胞マーカーの分布を評価し、我々は彼らの表面タンパク質14の分析に基づいて個々のデング熱ウイルス（DENV）の成熟を研究し、健康なボランティアと患者の血流中に放出電気自動車を調査しました急性冠症候群（ACS）を持ちます。同様の原理に基づいているが、新しい技術の適用は、以下に記載されている特定のプロトコルの開発を必要としました。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来のフローサイトメーターは、個々のレベル18上の物理的および化学的特性に基づいて細胞を分析するための主要なツールのまま。流れの基本的な原理は、フローサイトメトリーの開発以来、変更されていない：レーザービームを通過した光を散乱させる細胞は、細胞に結合した蛍光抗体により放射された蛍光スペクトルの記録をトリガするイベントを構成しています。彼らはほとんどが光18を収集することはありませんフローサイトメーターれる大きな角度の下でより多くの光を散乱として300 nm以下の小さな粒子は、サイトメーターの側方散乱によって検出することができません。ここに記載された技術は、蛍光がトリガーで、従来のフローサイトメーターにより、多数の個々のウィルスや電気自動車の識別および複数の抗原の分析を可能にします。
プロトコル内の重要なステップはのMNPに対する抗体のカップリングです。我々の実験はperforましたMED反応基としてカルボン酸を有する15nmの酸化鉄ナノ粒子を使用して前述のように 9。製造業者によると、それぞれ15nmのMNPは20の抗体の最大結合することができます。我々は、約15 nmのMNPあたり10抗体に結合します。この推定は、結合前後の抗体の量及びナノ粒子特性評価およびサイジング計器によって測定されたビーズ/ mLの数に基づいています。原理的には、結合は、粒子の凝集を引き起こし、望ましくないことができます。その凝集が私たちのプロトコルで起きていないかを確認するには、我々は、ナノ粒子の特性評価およびサイジング計装でこれを確認しました。この機器は、コーティングおよび抗体層だけではなく15 nmのコアを含む粒子のための流体力学的直径を測定します。私たちは、結合されたビーズの大部分は単一のピークに位置していること（73±7.3 nm以下のすべてのイベントの90％と64.7±4.2 nmにピークを意味する）が見つかりました。 AB-MNPの共同の混合MNPは、電気自動車/ビリオンよりも数オーダーの濃度になるように、右の割合でビリオンまたは電気自動車とmplexesが重要です。これは、単一の電気自動車/ビリオンが分析されていることを確認することが重要です。低流量でサイトメーター実行することにより、イベントの偶然の一致を避けます。蛍光の獲得をトリガし、捕捉した事業体の濃度を測定する体積のコントロールを使用するようにしてください。
しかし、のMNPは、架橋することによって、または同じナノ粒子に二つ以上のビリオンの結合によって電気自動車またはビリオンを集約することができます。これを確認するために、 図4で説明したように、凝集のためにテストが実行されなければなりません。個別に撮影したビリオンまたは電気自動車であっても、同時に、フローサイトメーターのレーザービームを入力することができます。これは、2つの異なる抗原に対して偽陽性を作成します。これを避けるために、説明したようにフローサイトメーターは、設定されるべきであるとの製剤は、希釈してください。一つは、一致がそれを用いて発生しているかどうかを確認することができ前のポイントで説明したように戦略。また、一致の欠如は、調製物の連続希釈液を分析し、蛍光染色された抗原の平均蛍光強度は、全ての希釈（ 図5）に一定のままイベントの数は、希釈して直線的に減少することを証明することによって確認することができます。別の問題は、あまりにも少ないウイルス/電気自動車を捕捉することができることです。これは、それらが特定のMNPによって捕捉され、それを通して抗原を運ぶウイルス/電気自動車の真の不足であることができます。また、捕獲の効率は様々な理由により低い（ 例えば 、MNPの、このプロトコルのために開発されたビリオン/電気自動車へのMNPの比からのずれなどに対する抗体の非効率的なカップリング）。後者の可能性を回避するために、捕獲の効率を具体的に評価されるべきです。一般的に、効率は、図6のように、約90％であるべきです。
異なる抗体が原因に干渉することができます互いの又はのMNPに結合された抗体を用いた立体障害。確認するにはセクション7簡潔に言えばで説明したように、これは（逆キャプチャプロトコルをテストする必要があり実現しなかったことを、ビリオンまたは電気自動車は、第一の蛍光検出のAbで染色した後、上のフリーフローティングABSからその後の分離とのAb-MNP複合体によって捕捉されるべきです磁気カラム。
フローvirometryは、ビリオンまたは電気自動車の抗原性組成物の分析の既存の方法に関して重要な利点を有しています。ルーチン生化学的方法は、調製物中の特定のタンパク質の一般的な存在に報告するが、ビリオンまたは電気自動車の異質性についての情報を提供しません。これは、大規模な商業的に入手可能な粒子にビリオンまたは電気自動車の免疫捕捉が含まれています。そのような粒子は直径数ミクロンの、一般的であり、それらのそれぞれは、ビリオンまたは電気自動車の数百または数千をキャプチャすることができます。したがって、任意の後続の分析平均ビリオン/電気自動車の特性一つの粒子によって捕獲しました。対照的に、フローvirometryは、直径10~15 nmでのMNPを使用して記述されたプロトコルを用いてイベントの少なくとも90％が単一ビリオンまたは単一EVを表します。
主な制限は、準備中のビリオンまたは電気自動車の集団全体が分析されない可能性があることですが、のみキャプチャされています。このように、ビリオンまたは電気自動車が捕獲されるときに通過する抗原の選択が重要になります。また、異なる抗原の数（異なる抗原に対する蛍光抗体の数）サイトメトリーとは異なり、流れはビリオンまたは電気自動車の小さな表面によって制限されています。最後に、別の抗体が立体的に小さいため（細胞と比較して）表面に再び互いに干渉することができます。
現在のプロトコルは、任意の起源の任意のウイルスまたはEVの分析に適合させることができ、それらを捕捉することができるを通じて特異的抗体が利用可能であることを条件とします。個々のビリオン許可証上の抗原の分析ウイルス集団の異なる画分の病因に対処するための研究者。また、血漿中の個々の電気自動車の同定は、それが可能な特定の細胞に電気自動車の起源をトレースすると、正常または病的これらの細胞の状況とそれらが存在する臓器について報告することがあります。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials
| Materials | |||
| Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
| 5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
| DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
| Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
| Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
| EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
| PBS | Gibco | 10010-23 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
| 123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CytoCount beads | Dako | S2366 | |
| AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
| Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
| OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | none | |
| NanoSight NS300 | Malvern | none | |
| BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Flowjo software | Flowjo | ||
| BD FACSDiva software | BD |
Referenzen
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