変更されたカフを用いた膵臓移植マウス モデル

同種免疫反応を避けるために、虚血再灌流傷害関連のグラフト損傷を厳密に調査するため、同系のドナー-受信者ペアを使わなければなりません。このプロトコルは、男性 C57BL6 (H2b) 10-12 週齢では 26 に 28 グラムの重量を量るマウスがサイズ一致ドナー-受信者ペアとして使用されました。すべての動物はバリア病原体の無料施設で収容された送受信に従って、「校長の研究室動物ケア」医療総合」ガイドのためのケアと使用の実験動物」国民の社会によって定式化されたヒューマン ・ ケア全米科学アカデミーによる準備し、健康の国民の協会 (NIH 文書番号 86-23 1985 を改訂) 刊します。オーストリア教育・科学・文化省は、この原稿 (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011) に記載されている実験を承認しました。 1. 膵の調達 腹腔注入キシラジン (5 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) (G) にある、27 g の針を使用してドナー動物を麻酔します。 電気シェーバーを使用して腹部の毛を剃る、テープの鎖で仰臥位で術野にマウスを修正します。 3 回クロルヘキシジンに浸したガーゼで術野をスクラブします。 はさみを使用して二国間弓下拡張子を持つ正中腹部切開を実行します。慎重に滅菌綿棒で左に内臓を外在、湿らせたガーゼに包んでください。次の手順で腹腔内の最大の露出を提供する蚊クランプと頭側、xyphoid を持ち上げます。 19 G の針を使用して、生殖の 400 μ L 下大静脈 (IVC) にヘパリン投与の 1:4 ヘパリン ナトリウム塩化物溶液を注入します。針を除去した後、動物を安楽死させるデスメタルが大動脈の transecting によって。 軽く湾曲した先端の鉗子を用いた線維組織を分離することにより腹部大動脈上腸間膜動脈の起源と右腎動脈の間を解剖します。大動脈を弱体化させるし、8/0 絹糸を結紮でそれを縛る。 Postpyloric 十二指腸と肝門部、肝十二指腸間膜を識別します。幽門結紮後胆管嚢胞性の管の入り口の下を分割し優しく解剖し、門脈を受信者で吻合部を実行するための十分な長さにできるだけ遠位トランセクトします。 湾曲した先端の鉗子を使用して、以前の合字から腹部大動脈を解剖ぶっきらぼう (1.6 の手順を参照してください)。湾曲した先端の鉗子を用いた傍大動脈組織を弱体化させる、8/0 シルクの合字とそれを結ぶし、ハサミ トランセクトします。 バイポーラ鉗子を使用すると、腰椎に枝を凝固、血管吻合のために十分な長さを提供するために、ダイヤフラムにできるだけ密接にハサミで大動脈をトランセクトします。最後に、既に結ばれた左腎動脈上大動脈を縦断面します。 門脈から来る明確な排水があるまでは、腹部大動脈を介して順行性の方法で 4 ° C ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸灌流液 5 mL で 19 G 注射器で膵臓を灌流します。浮腫の形成を避けるために低圧を適用します。注: は、回復したグラフトの暖かい虚血性劣化による任意のバイアスを避けるために高速かつ標準化された方法で 1.9 手順 1.5 を実行します。 滅菌綿棒を使って腹腔内に内臓を交換してください。 Treitz 靱帯に到達するまで postpyloric 十二指腸と前進から段階的な膵臓を別湾曲した先端の鉗子を使用します。これらの手順については、膵臓と十二指腸の壁の間の無血管である膠原病領域を識別します。 膵臓と十二指腸との間のブリッジの船を分離するために湾曲した先端の鉗子を使用してこれらの領域を解剖ぶっきらぼう。各分離血管構造の周りを 8/0 絹糸を結紮を渡すし、それを結ぶ。 最後に、十二指腸の壁に向かってハサミで血管構造を縦断面します。同じファッションで腸間膜, 横行結腸と胃から膵臓を分離するのに 8/0 シルク縫合糸を使用します。注: この手順の間、開口膵管は結紮します。 はさみで切ると頭側胃を持ち上げて、胃と短い胃枝、脾臓から実行している胃脾の靭帯を識別します。回復したグラフトに接続されている脾臓を残します。注: 移植加温を最小限にするため、継続的に 19 G の針で 10 mL の注射器を使用して、氷の上保存されている冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸灌流液で膵臓を灌漑します。 最後に、鉗子、脾臓をつかんでドナーサイト (図 1 b) から膵臓を削除し、受信者に転送します。 また、重症虚血再灌流障害を誘発するグラフト溶液中で保存滅菌、4 ° C 灌流 16 h の受信者の動物にそれを注入する前に。 2. 受信者の準備 I. p. 注入キシラジン (5 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) 27 G の針を使用して受信者の動物を麻酔します。 右横ずれの頸部、電気シェーバーを使用してひげをそるし、仰臥位で術野上にマウスを置きます。テープの繊維を使用してマウスを修正します。呼吸を損なうことを避けるためにフロント手足を overstretching は避けてください。 クロルヘキシジンに浸したガーゼを使用して 3 つの術野をスクラブします。 右傍、右下顎角に頸静脈切開からやや斜め皮膚切開を行います。 露骨に識別し、右外頚静脈の側枝を動員します。バイポーラ鉗子でそれらを凝固し、ハサミでそれらを縦断面。 頭側の顎下腺の唾液腺右葉を持ち上げて血管茎を識別し、バイポーラ鉗子を用いた焼灼します。焼灼の茎をハサミで transecting して、葉を削除します。 手順 2.5 にアナロジーで外頚静脈のすべての内側の枝を識別、バイポーラ鉗子でそれらを焼灼し、ハサミでそれらを縦断面。鉗子先端が曲線状で、可能な限り頭側外頸静脈を弱体化させるし、合字の間の十分なスペースを残して、2 つ 8/0 シルク合字とそれを縛る。 まっすぐハサミで 2 つの以前に配置した合字間外頸静脈を縦断面します。 ポリエチレン カフ (0.75 mm の内径、外径 0.94 mm), 外頸静脈の近位端を通過し、静脈 microhemostat クランプとカフのハンドルを修正します。 血管断端の終わりにネクタイを削除し、, カフ上容器を片脚します。循環 8/0 – シルク合 (図 1 a) を持つカフ上すぼまりの静脈を修正します。 近位および遠位右胸鎖乳突筋の表面的な部分を焼灼、ハサミ、トランセクト法とそれを削除します。 優しく総頸動脈を動員、分岐、下それを弱体化させるし、総頸動脈の分岐部を結ぶことを確かめる 2 回、それを縛る。関係の容器をカットします。 2.9 をステップ、ポリアミド カフ (内径 0.6 mm の外径の 0.57 mm)、総頚動脈の近位端を渡すし、動脈の血管クランプで固定のようです。 血管断端の終わりに合字を外し、優しく容器 dilatators を使用して内腔を広げます。動脈のカフ上容器を中村し、8/0 絹糸を結紮 (図 1 a) でそれを修正します。 3. 注入 場所頭で、ハンドルとして脾臓を使用して受信者の頸部に移植指向横方向に、内側、脾臓を含む尾と容器の切り株の頬骨尾。正しい位置に移植する使用綿棒。 されて以前外反し、受信者動物の外頚静脈上膵移植の門脈を軽く引いて、適切なカフで固定 (手順 2.10 参照)。循環 8/0 絹糸を結紮でそれを修正します。 受信者の動物のすぼまり総頸動脈にグラフトの大動脈の断端を引き出します。円周 8/0 シルク合 (図 1) を持つには、それを修正します。 脾臓の肺門の近くに脾臓の血管を特定し、湾曲した先端の鉗子で彼らを弱体化させます。8/0 シルク合字でしばるし、脾臓を削除する脾臓の血管を縦断面。最後に、ネクタイを短きます。 静脈の袖口にクランプを最初に削除鉗子の適用クランプを使用して、します。動脈クランプを削除します。注: 移植が成功した場合は、膵臓移植はすぐに均一のピンク色と表示される動脈の脈動 (図 1) を示すが reperfused されます。 常温食塩水で移植を湿らせます。 ストレートの鉗子を用いた静脈カフのハンドルを削除します。 実行中の手術創を閉じる 6/0 縫合。 4. 術後のケア (エンドポイント) 皮下に 0.5 mL 生理食塩水入りを適用、手順に従って (サウスカロライナ) 19 G の針を使用して術中の流体損失の交換。 麻酔からの完全な回復まで加熱パッドで受信者の動物を維持します。 一度目を覚まし、受信者の動物に戻る住宅施設、それが持つことができる食品と水の自由。 術後の痛みを防ぐためには、管理操作 (1) Buprenorphin (0.1 mg/kg マリンスイーツ) 直後後 12 時間間隔の最初の 5 日間、(2) カルプロフェン 4 mg/kg マリンスイーツ 12 時間間隔の最初の週のサウスカロライナ。 適切な栄養摂取量を推定するために各受信者の動物の重量 (g) を毎日監視します。手術日、無関心、壊滅的な非常に曲がった背中だけでなく感染症手術側の重量と比較して 10-15% 以上の体重減少は、エンドポイントを表します。 この場合と同様、臨床的エンドポイントに到達した後は、ターミナル イソフルラン吸入を使用して動物を犠牲します。