JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Maus-Modell für die Bauchspeicheldrüse Transplantation mit einer modifizierten Manschette-Technik

Published: December 16, 2017
doi:
10.3791/54998
, , , , , , , ,
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery,Medical University Innsbruck, 2Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Medical University Innsbruck, 3Department of Cardiac Surgery,Medical University Innsbruck, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Abdominal-solide Organtransplantationen gehören Pankreas-Transplantationen anfällig für schwere Ischämie Reperfusion Verletzungen-assoziierten Transplantat Schaden, führt schließlich zum frühen Transplantat Verlust zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt ein Modell der murinen Pankreas-Transplantation mit einer Manschette-Naht-Technik, ideal geeignet für die Analyse dieser frühen, schädlichen Schäden.

Abstract

Maus-Modelle haben mehrere Vorteile in der Transplantation Forschung, einschließlich einfache Handhabung, eine Vielzahl von genetisch genau definierten Stämme und die Verfügbarkeit von den unterschiedlichsten molekularen Sonden und Reagenzien in Vivo sowie in durchführen Vitro Studien. Basierend auf unserer Erfahrung mit verschiedenen Modellen der murinen Transplantation, entwickelten wir eine heterotopisch Bauchspeicheldrüse Transplantation bei Mäusen mit der Absicht, die Mechanismen, die schwere Ischämie Reperfusion Verletzungen verbundenen frühen Transplantat Schäden zu analysieren. Im Gegensatz zu den zuvor beschreiben beschriebenen Techniken mit Nahttechniken, hierin wir ein neues Verfahren mit einer Manschette-Naht-Technik.

In den letzten Jahren haben wir mehr als 300 Pankreas-Transplantationen bei Mäusen mit einer Erfolgsquote von durchgeführt > 90 %, eine Erfolgsrate nie beschrieben, bevor in der Maus-Pankreas-Transplantation. Das Rückgrat dieser Manschette-Naht-Technik zur Revaskularisation Transplantat besteht aus zwei Hauptschritten: (I) ziehen die Empfänger Schiff über ein Polyethylen/Polyamid-Manschette und fixieren es mit einer umlaufenden Ligatur und (II) platzieren die Spender-Schiff über die umgestülpt Empfänger Schiff und fixieren es mit einer zweiten umlaufende Ligatur. Die daraus resultierende Kontinuität der endotheliale Schicht führt zu weniger thrombogene Läsionen mit hohen Durchgängigkeit und schließlich hohe Erfolgsquoten.

In diesem Modell wird arteriellen Anastomose durch Ziehen der Bauchschlagader des Transplantats Spender über die ausladenden gemeinsame Halsschlagader des Empfängers Tieres erreicht. Venösen Abfluss des Transplantats wird durch Ziehen der Pfortader des Transplantats über die ausladenden äußere Halsschlagader des Empfängers erreicht. Diese Handschrift enthält Details und entscheidenden Schritte der Orgel Erholung und Orgel Implantation Verfahren, die Forscher mit mikrochirurgischen Fähigkeiten die Transplantation erfolgreich in ihren Laboren durchführen lässt.

Introduction

Simultane Nieren-Pankreas-Transplantation (SPK) repräsentiert den aktuellen Stand der Versorgung von Patienten mit Diabetes Mellitus und Ende Stadium Nierenkrankheit. Erfolgreiche Transplantation führt zu langfristigen Insulin Unabhängigkeit Stabilisierung oder sogar Regression der diabetischen Mikroangiopathie und eine bessere Lebensqualität1zugeordnet. Pankreas-Transplantationen sind jedoch im Gegensatz zu anderen gemeinsamen solide Organtransplantationen wie Niere und Leber-Transplantation, anfälliger für Ischämie Reperfusion Verletzungen (IRI). Gemeldete Fälle von bis zu 35 % gefährden nicht nur Transplantat, sondern sogar Patienten, überleben2,3.

Oxidativer Stress, mikrozirkulatorischen Störungen, erhöhte Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen und Adhäsionsmoleküle führt schließlich in endotheliale Aktivierung und Verlust seiner Integrität sind alle zugeschrieben worden diese Verletzung nicht allogene Transplantat 4. So weit, die genauen molekularen Mechanismen der IRI sind weitgehend unbekannt und können variieren von Orgel zu Orgel.

Trotz großer Fortschritte in-vitro- Modelle nutzen ist die Entwicklung von Tiermodellen zur Vertiefung der Kenntnisse der molekularen Mechanismen in der Graft IRI-assoziierten Veränderungen nach Pankreas-Transplantation entscheidend. Nagetiere5,6wurden mehrere Pankreas-Transplantation-Modelle entwickelt, aber nur in Mäusen7berichtet wird. Die Achillesferse dieser anspruchsvollen mikrochirurgischen Verfahren ist die geringe Überlebensrate von 46 %. Mausmodelle vertritt jedoch das beste Modell für Transplantation bezogene Forschung, da die unterschiedlichsten molekulare Analyse-Tools auf sie angewendet werden kann. Basierend auf umfangreichen mikrochirurgische Erfahrung bei Mäusen mit anderen Organ Transplantationen8,9,10, entwickelten wir eine neue, hoch reproduzierbare Technik für heterotopisch, zervikale Bauchspeicheldrüse Transplantation bei Mäusen mit > 90 % Erfolgsquote mit einer Manschette-Naht-Technik. Mit dieser Technik Anastomosen-Komplikationen sind auf ein Minimum reduziert und eine hohe Erfolgsquote im Vergleich zu der Naht Modell11erreicht werden. Bisher wurde nur ein Maus-Modell mit ähnlichen Erfolgsraten von Liu Et Al12beschrieben. Allerdings gibt es keine Studien, die mit diesem Modell so weit veröffentlicht.

Protocol

Zur Vermeidung von Alloimmune Antworten und streng Ischämie Reperfusion verletzungsbedingte Transplantat Schaden zu untersuchen, sollte ein Phänomen Geber-Nehmer-paar verwendet werden. In diesem Protokoll, männliche C57BL6 (H2-b) 10-12-Wochen alten Mäuse mit einem Gewicht von 26 bis 28 g dienten als Spender-Empfänger-Paare Größe angepasst. Alle Tiere wurden in einer Barriere Erreger frei Anlage untergebracht und erhielt menschlichen Obhut in Übereinstimmung mit den “Prinzipien von Labor Tier Pflege” formuliert von der nationalen Gesellschaft für medizinische Forschung und die “Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstiere” von der National Academy of Sciences und veröffentlicht von der National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 86-23, überarbeitet, 1985). Das Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur genehmigt die Experimente in diesem Manuskript (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011) beschrieben. 1. die Bauchspeicheldrüse Beschaffung Spendertieres mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion (5 mg/kg Körpergewicht) Xylazin und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) mit einer 27-Gauge-Nadel (G) zu betäuben. Rasieren Sie das Haar in der Bauchregion mit einen elektrischen Rasierer zu, und befestigen Sie die Maus auf das Operationsfeld in Rückenlage mit Strängen von Band. Schrubben Sie das Operationsfeld dreimal mit Chlorhexidin getränkten Gazen. Führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit einer bilateralen subcostal-Erweiterung mit einer Schere. Sanft exteriorize die Eingeweide auf der linken Seite mit sterilen Baumwolle Stöcken, und wickeln Sie sie in eine befeuchtete Gaze. Heben Sie die Xyphoid cranially mit einer Mücke Klammer für die folgenden Schritte ermöglichen maximale Belichtung der Bauchhöhle. Spritzen Sie mit Hilfe einer Nadel 19 G 400 µL einer sterilen 1:4-Heparin-Natrium-Chlorid-Lösung für Heparinisation in der unteren Hohlvene (IVC). Nach dem Entfernen der Nadelöhrs, einschläfern Sie das Tier durch Entbluten vor der Aorta. Sezieren der Bauchschlagader zwischen dem Ursprung der überlegenen mesenterialen Arterie und der rechten Nierenarterie durch das Bindegewebe mit gebogene Spitze Pinzette sanft zu trennen. Untergraben Sie die Aorta zu und binden Sie es mit einer 8/0 Seide Ligatur. Identifizieren Sie das Hepatoduodenal Ligament, die zwischen den postpyloric Zwölffingerdarm und die Leber Hilum verläuft. Teilen Sie den Gallengang unter dem Eingang der Cysticus nach distalen Ligatur und sanft sezieren und Transekt Portalader distal wie möglich genügend Länge für die Durchführung der Anastomose in den Empfänger haben. Mit gebogene Spitze Pinzette, unverblümt sezieren der Bauchschlagader, ausgehend von den bisherigen Ligatur (siehe Schritt 1.6). Das Periaortic Gewebe mit gebogene Spitze Pinzette zu untergraben, binden Sie es mit einer 8/0 Seide Ligatur und mit einer Schere Transekt. Mit bipolaren Pinzette, seine Lenden Zweige gerinnen und Transekt der Aorta mit einer Schere so nah wie möglich an das Zwerchfell, um genügend Länge für Schiff Anastomose zu schaffen. Endlich, die bereits gebundene Aorta oberhalb der linken Nierenarterie Transekt. Durchspülen der Bauchspeicheldrüse mit einer 19 G Spritze mit 5 mL 4 ° C Histidin-Tryptophan-Ketoglutarate Perfusion Lösung in eine Antegrade Mode über die Bauchaorta bis gibt es eine klare Abwasser aus der Pfortader. Niedriger Druck, Ödem-Bildung zu vermeiden.Hinweis: Führen Sie Schritte 1,5 bis 1,9 auf schnelle und standardisierte Weise jede Bias durch warme ischämischen Verschlechterung der wiederhergestellten Prothese zu vermeiden. Ersetzen Sie die Eingeweide in die Bauchhöhle mit sterilen Baumwolle-Sticks. Mit gebogene Spitze Pinzette, trennen Sie die Bauchspeicheldrüse schrittweise ab den postpyloric Zwölffingerdarm und voran bis zum Erreichen der Ligamentum Treitz. Für diese Schritte avaskulären Bindegewebe Bereiche zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Zwölffingerdarm Wand zu ermitteln. Unverblümt sezieren Sie diese Bereiche mit gebogene Spitze Pinzette um Überbrückung Schiffe zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Zwölffingerdarm zu isolieren. Übergeben einer 8/0 seidenen Ligatur um jede isolierte Gefäßstruktur und binden Sie es. Zu guter Letzt die Gefäßstruktur Transekt mit einer Schere in Richtung der duodenalen Wand. Verwenden Sie in der gleichen Weise ein 8/0 Seide Naht um die Bauchspeicheldrüse aus dem Mesenterium, das Colon transversum und den Magen zu trennen.Hinweis: Während dieses Vorgangs ist die Choledocho-Pankreasgang ligiert. Das Gastrosplenic Ligament laufen aus der Milz, der Magen, und die kurze gastrische Zweige durch Anheben des Magens cranially und schneiden mit Schere zu identifizieren. Lassen Sie die Milz an der wiederhergestellten Prothese befestigt.Hinweis: Um zu minimieren, Transplantat Wiedererwärmung, bewässern Sie die Bauchspeicheldrüse, die kontinuierlich mit einer 10 mL Spritze mit einer Nadel 19 G mit der kalten Histidin-Tryptophan-Ketoglutarate Perfusion Lösung auf Eis gelagert. Zu guter Letzt die Bauchspeicheldrüse von der Entnahmestelle (Abbildung 1 b) durch das Greifen der Milz mit der Pinzette zu entfernen, und in den Empfänger übertragen. Alternativ zum schweren Ischämie Reperfusion Verletzungen auslösen, das Transplantat in Lösung zu lagern steril, 4 ° C Perfusion für 16 h vor dem Empfänger Tier implantiert. 2. Empfänger Vorbereitung Der Empfänger Tier mit einer Injektion i.p Xylazin (5 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) mit einer 27 G Nadel zu betäuben. Rasieren Sie den rechten seitlichen Halsbereich mit einen elektrischen Rasierer zu, und platzieren Sie den Mauszeiger auf das Operationsfeld in Rückenlage. Befestigen Sie die Maus mit Stränge der Band. Überdehnung der vorderen Gliedmaßen, um zu vermeiden, Kompromisse bei der Atmung zu vermeiden. Schrubben Sie das Operationsfeld drei Mal mit Chlorhexidin getränkten Gazen. Machen Sie einen rechts Paramedian, leicht schräg Hautschnitt von der Vena Schnitt im rechten Unterkiefer-Winkel. Unverblümt zu identifizieren Sie und mobilisieren Sie die Seitenzweige direkt äußere Halsschlagader. Gerinnen sie mit bipolaren Pinzette und Transekt sie mit einer Schere. Heben Sie den rechten Lappen von der mandibulären Speicheldrüse cranially, identifizieren Sie die vaskuläre Knochenschrauben und Kauterisieren Sie es mit bipolaren Pinzette. Den Lappen durch die Kauterisation Pedikels mit einer Schere zu entfernen. Analog zu Schritt 2.5 erkennen alle medialen Zweige der äußeren Halsschlagader, Kauterisieren sie mit bipolaren Pinzette und Transekt sie mit einer Schere.Untergraben Sie die äußere Halsschlagader mit gebogene Spitze Pinzette so cranially, und verbinden Sie es mit zwei 8/0 Seide Ligaturen, so dass genügend Platz zwischen den Ligaturen. Die äußere Halsschlagader zwischen den zwei zuvor platzierten Ligaturen mit der geraden Schere Transekt. Das proximale Ende des äußeren Jugularvene durch die Polyethylen-Manschette (Innendurchmesser von 0,75 mm, Außendurchmesser von 0,94 mm) und befestigen Sie den Griff der Manschette mit einer venösen Microhemostat Klemme. Entfernen Sie die Krawatte am Ende des Schiffes stumpfes und evert das Schiff über die Manschette. Die ausladenden Vene auf der Manschette mit einer kreisförmigen 8/0 – Seide Ligatur (Abbildung 1A) befestigen. Proximal und distal Kauterisieren den oberflächlichen Teil der rechten sternocleidomastoideus-Muskel, mit einer Schere Transekt und entfernen Sie es. Sanft mobilisieren Sie die gemeinsame Halsschlagader, unterhalb der Bifurkation zu untergraben Sie, und verbinden Sie es zweimal, und achten Sie nicht auf die Halsschlagader Bifurkation zu binden. Schneiden Sie das Schiff zwischen den Bindungen. Ähnlich wie bei Schritt 2,9, passieren das proximale Ende der gemeinsamen Halsschlagader durch die Polyamid-Manschette (Innendurchmesser von 0,57 mm, außen-ø 0,6 mm) und mit einer arteriellen mikrovaskuläre Schelle befestigen. Entfernen Sie die Ligatur am Ende der vaskulären stumpf, und erweitern Sie sanft das Lumen mit Schiff Dilatatoren. Das Schiff über die arterielle Manschette Evert, und befestigen Sie es mit einer 8/0 Seide Ligatur (Abbildung 1A). (3) implantation Ort das Transplantat in der Empfänger-Hals-Bereich mit der Milz als Griff, mit dem Kopf seitlich, einschließlich der Milz medial Heck und die Schiff-Stümpfe Ventro-kaudal ausgerichtet. Verwendung Baumwolle hält sich an die Prothese richtig zu positionieren. Ziehen Sie vorsichtig die Pfortader der pankreatischen Prothese über den Empfänger des Tieres externe Halsschlagader, die zuvor umgestülpt wurden, und auf die entsprechenden Manschette fixiert (siehe Punkt 2.10). Mit einem Rundschreiben 8/0 Seide Ligatur befestigen. Ziehen Sie den Stumpf der Bauchschlagader des Transplantats über die ausladenden gemeinsame Halsschlagader des Empfängers Tieres. Mit einer umlaufenden 8/0 Seide Ligatur (Abbildung 1) befestigen. Die Milz Schiffe in der Nähe von Hilum der Milz zu identifizieren und mit gebogene Spitze Pinzette zu untergraben. Binden sie mit 8/0 Seide Ligaturen und Transekt Milz Schiffe um die Milz zu entfernen. Zu guter Letzt verkürzen Sie die Bande. Mit einer Schelle Zange anwenden, entfernen Sie zuerst die Klammer auf der venösen Manschette. Entfernen Sie dann die arterielle Klemme.Hinweis: Wenn die Transplantation erfolgreich war, wird die Bauchspeicheldrüse Transplantation reperfused werden sofort zeigt eine homogene rosa Farbe und sichtbare arterielle Pulsation (Abbildung 1). Befeuchten Sie das Transplantat mit normothermic Kochsalzlösung. Entfernen Sie den Griff der venösen Manschette mit geraden Pinzette. In der Nähe der Operationswunde mit einem laufenden 6/0 Naht. 4. postoperative Pflege (Endpunkt) Nach dem Eingriff gelten bis zu 0,5 mL normale Kochsalzlösung subkutan (s.c.) für den Ersatz der intraoperativen Flüssigkeitsverlust mit Hilfe einer Nadel 19 G. Halten Sie das Empfänger Tier auf ein Heizkissen bis zur vollständigen Genesung von Anästhesie. Einmal wach, wieder den Empfänger Tier Wohnanlage, wo es haben Essen und Wasser Ad Libitum. Zur Vermeidung von postoperativen Schmerzen verwalten direkt nach der Operation (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg b.w.) alle 12 h für die ersten 5 Tage und 4 mg/kg b.w. Carprofen (2) alle 12 Std. s.c. für die erste Woche. Überwachen Sie Gewicht (g) der einzelnen Empfänger Tiere um richtige Nahrungsaufnahme abschätzen zu können, jeden Tag. Ein Gewichtsverlust von mehr als 10-15 % im Vergleich zum Gewicht am OP-Tag, Apathie, lähmend, ein sehr gebeugtem Rücken sowie chirurgische Seite Infektionen sind Endpunkte. In diesem Fall, wie auch nach erreichen der klinischen Endpunkt, das Tier mit terminal Isofluran Inhalation zu opfern.

Representative Results

In den letzten zehn Jahren haben wir mehr als 300 Pankreas-Transplantationen bei Mäusen durchgeführt. Nach der Gründung des Protokolls, gab es ein Gesamtüberleben von > 90 %. Postoperative Blutungen waren die Hauptursache für das Scheitern, gefolgt von Thrombose Transplantat mit anschließenden tödlichen nekrotische Transplantat Pankreatitis. In beiden Fällen Endpunkte wurden innerhalb von 24 h erreicht und Tiere geopfert wurden. Keine neurologischen Störungen, Symptome wie Dysphagie und chirurgische Seite Infektionen in dieser Serie gab es nicht. Um die endokrine Funktion der transplantierten Grafts zu untersuchen, und damit die Durchgängigkeit des Modells zu überprüfen, wurde im Empfänger Mäuse durch Vorbehandlung mit einer Einzeldosis von intraperitoneal angewandte Streptozocin (312,5 mg/kg Körpergewicht) Hyperglykämie induziert 4 Tage vor der Operation. Mäuse galten Blutzuckerspiegels Blutzuckerspiegel wären > 300 mg/dL. Abbildung 2A zeigt die Blutzuckerwerte der verschiedenen Gruppen. Mäuse erhalten Transplantate ohne eine längere kalten Ischämie-Zeit von 16 h Normogylcemia innerhalb von 24 h nach Transplantation erreicht und aufrechterhalten dieser metabolischen Zustand über den gesamten Beobachtungszeitraum. Im Gegensatz dazu blieb nicht transplantiert Tiere Hyperglykämie. Da wir die Auswirkungen der Ischämie Reperfusion Verletzungen-assoziierten Transplantat Schaden auf endokrine Funktion interessiert waren, haben wir eine dritte Gruppe wo Transplantate ausgesetzt wurden um 16 h verlängert kalten Ischämie (CIT) und 45 min. von warmen Ischämie (WIT). Mäuse erhalten diese Transplantate nicht erreichen, Normoglycemia und nach 48 h aufgrund der Entwicklung der schweren Pankreatitis, die gezeigt wurde, in diesem Modell13tödlich sein geopfert werden musste. Dieses Modell eignet sich für verschiedene Projekte zur Ischämie Reperfusion Verletzungen verbundenen frühen Transplantat Schäden zu untersuchen. Weitere Untersuchungen enthalten, unter anderem intravitalen konfokale Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung der mikrozirkulatorischen Störungen 2 h nach Transplantation durchgeführt. Kontrast der Grafts Mikrogefäßen wurde verbessert durch die Injektion von 0,3 mL eine 0,4 % Fluorescein-Herstellung-Label Dextran (MW 150 000) in die Vene des Penis. Abbildung 2 b zeigt ein regelmäßiges kapillares Muster von einem naiven murinen Pankreas und ein transplantierten Bauchspeicheldrüse Prothese, die verlängerte CIT (Abbildung 2) nicht ausgesetzt war. Im Gegensatz dazu zeigt Abb. 2D die Aufschlüsselung der Mikrozirkulation durch Freilegung der pankreatischen Transplantats zu längeren CIT. Abbildung 1 : Intraoperative Bilder. (A) Intraoperative Sicht der Empfänger Schiffe Anastomose vorbereitet. Die äußere Halsschlagader (1) wurde über die venösen Polyethylen-Manschette umgestülpt und mit einer kreisförmigen 8/0 Seide Ligatur fixiert. In Analogie wurde die gemeinsame Halsschlagader (2) umgestülpt und über die kleineren arteriellen Polyamid-Manschette fixiert. Skala bar 1 mm. (B) der Bauchspeicheldrüse Transplantation ex-Situ. Die Pfortader (1) und den Stumpf der Bauchschlagader (2) für vaskuläre Anastomose erforderlich. Die Milz (3) wird zusammen mit der Bauchspeicheldrüse abgerufen und dient als Griff. Vor Reperfusion des Transplantats wird die Milz entfernt werden. Skala bar 1 cm. (C) Intraoperative Sicht auf die Anastomosen. Die Pfortader (1) ist über die Manschette des aufschwingenden äußere Halsschlagader gezogen (2) und mit einem kreisförmigen Seidenkrawatte 8/0 fest. Ebenso wird die Aorta Stumpf der Bauchschlagader (3) über die Manschette der aufschwingenden gemeinsame Halsschlagader (4) gezogen. Skala bar 1 mm. (D) Intraoperative Ansicht der perfundierten Pankreas Prothese nach 5 min Reperfusion: nach der Entfernung der Vene, gefolgt von der arterielle Klemme, ein erfolgreich transplantierten Bauchspeicheldrüse Transplantation zeigt eine homogene rosa Farbe. Die Milz wurde entfernt, bevor Reperfusion (1: aufgespaltenen Milz Schiff). Skala bar 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Endokrine Funktion des Pankreas Transplantats und konfokale in vivo Fluoreszenz-Mikroskopie. Abbildung 2A zeigt ein Liniendiagramm mit den Blutzuckerspiegel von transplantierten Mäusen ohne CIT (n = 10, PTX w/o CIT, blaue Linie), nicht transplantiert Mäuse (n = 11, keine PTX, rote Linie), und Mäuse erhalten Transplantate, verlängerte CIT ausgesetzt (PTX + 16 h CIT, n = 10, grüne Linie). Alle Empfänger wurden zuvor mit 312,5 mg/kg b.w. Streptozocin i.p hyperglykämischen gerendert. Während allen Empfängern der Transplantate ohne CIT mit intakten endokrine Funktion den gesamten Beobachtungszeitraum (50 Tage) überleben konnten, blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum nicht transplantierten Mäusen Hyperglykämie. Mäuse ausgesetzt bis 16 h CIT Transplantate erhalten nicht von Hyperglykämie erholen und 48 h nach Transplantation durch Gewichtsverlust von mehr als 10-15 % geopfert werden musste. Am Tag nach einer letzten Glycemia Messung 50 wurden Mäuse überleben den gesamten Beobachtungszeitraum geopfert. Mikrozirkulation im transplantierten Grafts wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie intravitalen 2 h nach Transplantation bewertet. Naive Bauchspeicheldrüse dienten als Kontrollen. Abbildung 2 b zeigt ein regelmäßiges kapillares Muster in der naiven Bauchspeicheldrüse. Eine regelmäßige Kapillare Netz sieht auch in transplantierten Grafts nicht unterworfen, verlängerte CIT (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu ist eine Aufschlüsselung der Mikrozirkulation in transplantierten Grafts ausgesetzt verlängerte CIT (Abb. 2D) beobachtet. Skala Bar 100 µm. Daten in der Grafik wird als ± Standardabweichung ausgedrückt. PTX: Pankreas-Transplantation; CIT: kalte Ischämie; w/o: ohne Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

IRI-assoziierten Transplantat Schaden solide Organtransplantationen inhärent ist, und zeichnet sich durch eine Störung der Mikrozirkulation. Anhäufung von mehreren Metaboliten während der ischämischen Phase und Initiierung von entzündlichen Kaskaden, die vor allem durch reaktiven Sauerstoff und Stickstoff-Spezies, führt zu Gewebeschäden bei Graft Reperfusion4vermittelt. Diese Kaskade kann nicht nur kurzfristige, sondern auch langfristig Erfolg gefährden und daher Patienten überleben14maßgeblich beeinflusst. Bis heute stellt die kombinierte Nieren-Pankreas-Transplantation die Therapie der Wahl für Patienten mit Typ 1-Diabetes mit End Stage renal Disease15dar. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine erfolgreiche kombinierte Nierentransplantation Bauchspeicheldrüse nicht nur wiederherstellen und Transplantat Nierenfunktion bei diabetischen Empfänger schützen aber auch stabilisiert oder sogar umkehrt sekundären Komplikationen, einschließlich Neuropathie sowie Mikro- und Makroangiopathie zu16,17,18.

Trotz kontinuierlichen Bemühungen in Minderung, Ersatz und Raffinesse (3 R) in Tierversuchen ist Wiedergabe von komplexen pathophysiologischen Prozessen wie IRI in in-vitro- Einstellungen nur unmöglich. Daher gelten Tiermodellen noch als das ideale Werkzeug für translationale Forschung19,20. Maus-Modellen wie dem hier beschriebenen haben mehrere Vorteile im Vergleich zur Ratte oder anderes Tier Modelle. Dazu zählen die Verfügbarkeit von Unmengen an genetisch genau definierten Inzucht Mausstämme (z.B. transgene und Knock-out-Stämme), eine Fülle von molekularen Analyse-Tools, sowie eine einfache und billige Umgang mit21. Ein wesentlicher Vorteil des beschriebenen Modells liegt in der Manschette-Naht-Technik. Mithilfe der hier vorgestellten Technik, Erfolgsraten von > 90 % sind realisierbar, was ist dramatisch besser im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Modelle22. Mit dieser nicht-Naht-Technik haben wir häufige Komplikationen wie Hypovolämischen Schock, Thrombose und Stenose der Anastomosen12deutlich reduziert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht aus der extra Bauch Position der Prothese, die mit schnelle postoperative Erholung des Empfängers verbunden ist. Darüber hinaus macht es die zervikale Lage bestens geeignet für in-Vivo -Analysen, wie live Bildgebung des Transplantats von Exterioration ohne jede Spannung22.

Der größte Nachteil dieses Modells ist die Okklusion der Pankreasgang, der klinische Realität nicht ähneln. In diesem Modell wird exokrinen Drainage durch das Binden der Choledocho-Pankreasgang verwaltet. Auf lange Sicht ergibt sich eine deutliche Fibrose und Atrophie der Drüse ohne führende Pankreatitis22zu verpflanzen. Aufgrund dieser Verschlechterung des exokrinen Gewebes, die wir schon beobachtet wie am 30. Tag nach der Transplantation, wir glauben, dass dieses Modell nicht für lange Begriff Beobachtung geeignet ist. Im Gegensatz dazu macht die ungestörte endokrine Funktion Gylcemic Steuerelemente des Empfängers ein einfaches Werkzeug für die tägliche Bewertung der Funktion des Transplantats13,23,24.

Diese Eigenschaften macht dies ein ideales Modell für die Analyse von frühen Transplantat Verletzungen verbunden mit langen Aufbewahrungsfristen oder mit verschiedenen Erhaltung Lösungen und Techniken. Um optimalen Erfolg mit diesem Modell zu erreichen, müssen mehrere entscheidende Schritte berücksichtigt werden. Die Bauchspeicheldrüse selbst ist sehr anfällig für Manipulationen. Daher, schonender Umgang mit Baumwolle-Sticks während der Wiederherstellung der Orgel und während der Implantation minimiert mechanische Trauma. Direkte greifen der Drüse mit der Pinzette sollte vermieden werden, da es unweigerlich zu schweren Transplantat Schäden führen würde. Aus dem gleichen Grund die Milz ist zusammen mit der Bauchspeicheldrüse erholt, und dient als Griff. Dies ist auch in der klinischen Praxis festgelegt. Ein weiterer Fallstrick beinhaltet kalte Perfusion, die durch Perfusion über die Aorta stumpf mit 4 ° C Histidin-Tryptophan-Ketoglutarate Perfusion Lösung erreicht wird. Hiermit kann eine übermäßige Schwellung der Drüse durch sanft Vorrichtung das Transplantat vermieden werden. Die restliche Perfusion Lösung sollte zum Befeuchten der Prothese verwendet werden, um die Temperatur niedrig zu halten während der Wiederherstellung der Orgel.

In Bezug auf Empfänger Vorbereitung setzt eine sorgfältige Dissektion der äußeren Halsschlagader sowie die gemeinsame Halsschlagader die Basis für erfolgreiche Revaskularisation. In bestimmten, komplette Exposition der Vene durch Entfernen nicht nur alle Zuflüsse, aber auch das umliegende Fettgewebe ist notwendig, um externe Kompression und Stenose durch verbleibenden Fettgewebe zu vermeiden. Die Auswahl der geeigneten Manschette Durchmesser ist entscheidend. Basierend auf gemeinsamen Erfahrungen, für Mäuse mit einem Gewicht von 25 bis 28 g, eignet sich ein Innendurchmesser von 0,57 mm für die arterielle Manschette und 0,75 bis 0,8 mm für die venöse Manschette. Präzise, sauber schneiden der Kanten der Manschetten ist zwingend erforderlich, um zu vermeiden, reißen den Schiff stumpf. Dilatation der Gefäße, insbesondere der Arterie, wird am besten erreicht, indem Schiff Dilatatoren mit feinen Spitzen. Als Faustregel gilt sollte das Schiff um zweimal das Lumen der Manschette erweitern können. Während des Prozesses der das Schiff über everting und Befestigung auf der Manschette empfiehlt es sich, vaskuläre Klemmen indem man sie unter einem Hautlappen zu stabilisieren, wie das diesen entscheidenden Schritt erleichtert.

Wie bereits erwähnt die nicht-Manschette-Nahttechnik stellt eine einfache Methode für vaskuläre Anastomose und innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden kann. Allerdings ist die korrekte Positionierung der Prothese in der Empfänger-Hals-Bereich von größter Bedeutung für die korrekte Revaskularisation. Dabei muss die letzte richtige Positionierung der Prothese im Hals-Bereich zu rechnen ist, um eine sichere, gerade und spannungsfrei Anastomose von der Arterie und der Vene zu ermöglichen. Schiffe, die zu lang sind, müssen vermieden werden, da dies zu einer Behinderung der Abfluss durch Knicken führen kann. Aus dem gleichen Grund sollten auch die Manschette-Griff in die venöse Anastomose nach Reperfusion entfernen. Im Falle einer lokalisierten Blutungen aus der Pankreas-Transplantation kann erfolgreiche Blutstillung durch sanft komprimieren der blutenden Seite für 5 min mit Baumwolle-Sticks erreicht werden. Dies ist der einzige erfolgreiche Weg, um diese Art von Komplikation zu verwalten.Kauterisation, obwohl hochselektiven Transplantat Verlust in fast allen Fällen durch nekrotische Pankreatitis geführt.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine Methode für die Bauchspeicheldrüse Transplantation bei Mäusen mit einer-Naht-Manschette-Technik, die technisch und mikrochirurgisch machbar und hat ausgezeichnete Erfolgsquoten entwickelt. Da die kontinuierliche Fibrose des Pankreas durch den Kanal Okklusion, eignet sich dieses Modell am besten für Forschungsbereiche mit Schwerpunkt auf frühen Transplantat Schäden. Dieses Manuskript soll Forscher sicher dieses Modell in ihren Laboratorien herstellen zu lassen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse #2008-1-596 und #UNI-0404/1956 der “Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)” (https://www.tirol.gv.at/en/) und von Grant #2013-042018 von der “Start-MUI-Förderungsprogramm” an der medizinischen Universität Innsbruck unterstützt.

Materials

Adventitia Scissors S&T S-00102 Straight
Dumont # 7 Forceps FST  11271- 30 Curved Tip 0.17 x 0.1 mm
Yasargil Clip Mini Permanent 7mm Aesculap FE720K
Micro vessel clip S&T B1 00396 V
Vessel dilatator S&T D-5a.2, 00125
Clip applier S & T CAF-4 00072 for venous cuff
Clip applier Aesculap FE572K  for the arterial cuff
Polyethylene tube Portex Ltd Inner diameter 0.75 mm for venous cuff
Polymide tubing Vention Medical  141-0051 Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd)
Polymide tubing Vention Medical 141-0033 Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff
Bipolar forceps Micromed 140-100-015
8/0 silk ligatures Catgut GmbH, Merkuramed 17209008
Custodiol HTK solution Dr. Franz Köhler Chemie 59997
Ketamin Graeub aniMedica GmbH 32554
Xylasol Graeub aniMedica GmbH 50855
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Gruessner, A. C. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).
  2. Troppmann, C. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).
  3. Fernández-Cruz, L., et al. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).
  4. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  5. Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).
  6. Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).
  7. Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).
  8. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753 (2014).
  9. Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).
  10. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).
  11. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).
  12. Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).
  13. Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).
  14. Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).
  15. White, S., Shaw, J., Sutherland, D. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).
  16. Morath, C., et al. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).
  17. Perseghin, G., et al. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).
  18. Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65 (1998).
  19. Kirk, A. D. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).
  20. de Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?–Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).
  21. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  22. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
  23. Cardini, B., et al. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570 (2014).
  24. Maglione, M., et al. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).

Tags

Mouse ModelPancreas TransplantationModified Cuff TechniqueKetamineXylazineMidline LaparotomyHeparinAbdominal AortaCommon Bile DuctPortal VeinRenal VeinCeliac TrunkAortic PatchPerfusion SolutionDuodenumLigament Of Treitz

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. R., Eiter, R., Hermann, M., Kofler, M., Schneeberger, S., Brandacher, G., Maglione, M. Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique. J. Vis. Exp. (130), e54998, doi:10.3791/54998 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image