JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Modèle de souris pour une Transplantation du pancréas en utilisant une Technique mis à jour le brassard

Published: December 16, 2017
doi:
10.3791/54998
, , , , , , , ,
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery,Medical University Innsbruck, 2Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Medical University Innsbruck, 3Department of Cardiac Surgery,Medical University Innsbruck, 4Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory,Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Parmi les transplantations d’organes solides abdominaux, greffes de pancréas sont enclins à développer des dommages associés aux blessures greffon reperfusion ischémie sévère, conduisant finalement à perte de greffe précoce. Ce protocole décrit un modèle de la transplantation de pancréas murine en utilisant une technique de suture non brassard, idéale pour l’analyse de ces dommages-intérêts au début, délétères.

Abstract

Modèles murins ont plusieurs avantages dans la recherche de transplantation, y compris la manipulation facile, une variété de souches génétiquement bien définies et la disponibilité de la large gamme de sondes moléculaires et réactifs pour effectuer en vivo ainsi que dans vitro études. Basé sur notre expérience avec divers modèles murins de la transplantation, nous avons développé un modèle de transplantation de pancréas hétérotopique chez la souris dans le but d’analyser les mécanismes qui sous-tendent une ischémie sévère reperfusion associées aux lésions précoces greffon dommages. Contrairement à auparavant techniques décrites en utilisant des techniques de suture, ci-après les auteurs décrivent une nouvelle procédure à l’aide d’une technique de suture non brassard.

Ces dernières années, nous avons effectué plus de 300 greffes du pancréas chez les souris avec un taux de réussite global de > 90 %, un taux de réussite jamais décrit avant dans la transplantation de pancréas de souris. L’épine dorsale de cette technique de suture non brassard pour la revascularisation de la prothèse se compose de deux principales étapes : (I) tirant le bateau qui reçoit le plus un brassard de polyéthylène-polyamide et en le fixant avec une ligature circonférentielle et (II) plaçant le navire donneur sur le éversée bateau qui reçoit et en le fixant avec une deuxième ligature circonférentielle. La continuité qui en résulte des résultats moins thrombogène des lésions avec des taux de perméabilité élevée couche endothéliale et, enfin, les taux de réussite élevé.

Dans ce modèle, anastomose artérielle est obtenue en tirant sur l’aorte abdominale de la greffe de donneur sur l’artère carotide commune éversion de l’animal receveur. Le drainage veineux de la prothèse est obtenu en tirant sur la veine porte du greffon sur la veine jugulaire externe d’éversés du destinataire. Cet article fournit des détails et des étapes cruciales de la récupération de l’orgue et les procédures d’implantation orgue, qui permettra aux chercheurs connaissant microsurgical effectuer la transplantation avec succès dans leurs laboratoires.

Introduction

Transplantation rein-pancréas simultané (SPK) représente la norme actuelle des soins pour les patients souffrant de diabète sucré et fin insuffisance rénale terminale. Transplantation réussie aboutit à l’indépendance de l’insuline à long terme associé à la stabilisation ou voire la régression de la microangiopathie diabétique et une meilleure qualité de vie1. Cependant, contrairement aux autres transplantations d’organes communs organes solides, comme les reins et une greffe du foie, greffes de pancréas sont plus sensibles à la lésion d’ischémie reperfusion (IRI). L’incidence signalées jusqu’à 35 % remettent en cause non seulement la prothèse, mais même patient, survie2,3.

Le stress oxydatif, troubles microcirculatoires, a augmenté l’expression de cytokines pro-inflammatoires et molécules d’adhérence résultant enfin activation endothéliale et la perte de son intégrité, ont tous été attribués à cette blessure de greffe allogénique-non 4. jusqu’ici, les mécanismes moléculaires exacts de IRI sont largement inconnus et peuvent varier d’un orgue à l’orgue.

Malgré des progrès majeurs utilisant des modèles in vitro , le développement de modèles animaux est crucial pour approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans les altérations IRI-associated graft consécutive à une transplantation du pancréas. Plusieurs modèles de transplantation de pancréas ont été développés dans les rongeurs5,6, mais seul est signalé en souris7. Le talon d’Achille de ce très exigeant une procédure microchirurgicale est le faible taux de survie de 46 %. Cependant, modèles murins représentent le meilleur modèle pour la recherche liée à la transplantation, puisque la plus grande variété d’outils d’analyse moléculaire peut être appliquée pour eux. Basé sur une vaste expérience de microchirurgie chez la souris avec différents organes greffes8,9,10, nous avons développé une nouvelle technique hautement reproductible pour pancréas hétérotopique, col de l’utérus la transplantation chez les souris avec > taux de réussite de 90 % en utilisant une technique de suture non brassard. Avec cette technique, les complications des anastomoses sont réduites au minimum, et un taux de réussite élevé peut être réalisé par rapport à la suture modèle11. Jusqu’à présent, un seul modèle de souris ayant des taux de succès similaires a été décrite par Liu et al.12. Cependant, il n’y a aucune étude publiée à l’aide de ce modèle jusqu’à présent.

Protocol

Afin d’éviter les réponses allo et d’étudier rigoureusement ischémie reperfusion greffe aux blessures des dommages, une paire de donateur-bénéficiaire syngénique doit servir. Dans le présent protocole, les mâles C57BL6 (H2b) 10-12-week-old souris pesant de 26 à 28 g servaient de même taille des paires de donateur-bénéficiaire. Tous les animaux étaient logés dans une usine exempte de pathogènes de barrière et a reçu des soins de l’homme dans le respect de la « directeurs de laboratoire animalerie » formulée par la société nationale pour la recherche médicale et le « Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals » préparé par la National Academy of Sciences et publié par le National Institutes of Health (NIH Publication n° 86-23, révisé de 1985). Le Ministère autrichien de l’Education, la Science et la Culture a approuvé les expériences décrites dans ce manuscrit (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011). 1. le pancréas des achats Anesthésier l’animal donneur avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de xylazine (5 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) à l’aide d’une aiguille (G) de calibre 27. Se raser les cheveux dans la région abdominale à l’aide d’un rasoir électrique et fixer la souris sur le champ opératoire en position couchée avec des brins de ruban. Frottez le champ opératoire trois fois avec des gazes imbibées chlorhexidine. Effectuer une incision abdominale médiane avec une extension sous-costal bilatérale à l’aide de ciseaux. Doucement extérioriser les viscères vers la gauche avec des bâtonnets de coton stérile et les envelopper dans une gaze humide. Soulever le xyphoid parotidien avec une pince de moustique pour assurer une exposition maximale de la cavité abdominale pour les étapes suivantes. À l’aide d’une aiguille 19 G, injecter 400 µL d’une solution stérile de solution de chlorure de sodium héparine 1:4 pour heparinisation dans la veine cave inférieure (VCI). Après avoir retiré l’aiguille, euthanasier l’animal par exsanguination transection de l’aorte. Disséquer l’aorte abdominale entre l’origine de l’artère mésentérique supérieure et l’artère rénale droite en séparant délicatement le tissu fibreux à l’aide de pinces à pointe courbée. Miner l’aorte et attachez-le avec une ligature soie de 8/0. Identifier le ligament de hepatoduodenal, qui se déroule entre le duodénum postpyloric et le hile du foie. Diviser la voie biliaire sous l’entrée du canal cystique après ligature distale et doucement disséquer et transect de la veine porte dans la partie distale que possible d’avoir assez de longueur pour réaliser l’anastomose chez le receveur. À l’aide de pinces à pointe courbée, disséquer sans ambages l’aorte abdominale à partir de la ligature précédente (Voir l’étape 1.6). Miner le tissu périaortique à l’aide de pinces à pointe courbée, attachez-le avec une ligature soie de 8/0 et il transect avec des ciseaux. À l’aide de pince bipolaire, coaguler toutes ses branches lombaires et transect l’aorte avec des ciseaux aussi étroitement que possible à la membrane, afin de fournir assez de longueur pour anastomose de navire. Enfin, transect l’aorte déjà attaché au-dessus de l’artère rénale gauche. Perfuse le pancréas avec une seringue de 19 G avec 5 mL de solution de perfusion de l’histidine-tryptophane-cétoglutarate de 4 ° C de façon antérograde par l’intermédiaire de l’aorte abdominale, qu’il y ait un effluent clair venant de la veine porte. Appliquer une pression faible pour éviter la formation d’oedème.Remarque : Effectuez les étapes 1,5 à 1,9 de façon rapide et standardisée pour éviter tout biais par chaude détérioration ischémique du greffon récupéré. Remplacer les viscères dans la cavité péritonéale à l’aide de bâtonnets de coton stérile. À l’aide de pinces à pointe courbée, séparer le pancréas par étapes à partir de la postpyloric duodénum et aller de l’avant jusqu’au ligament de Treitz. Pour ces étapes, identifier les zones du tissu conjonctif avasculaire entre le pancréas et la paroi du duodénum. Carrément disséquer ces zones à l’aide de pinces à pointe courbée afin d’isoler les navires de ponts entre le pancréas et le duodénum. Passer une ligature soie de 8/0 autour de chaque structure vasculaire isolée et la nouer. Enfin, transect la structure vasculaire avec des ciseaux contre la paroi du duodénum. De la même façon, utiliser une suture de soie de 8/0 pour séparer le pancréas de l’estomac, le côlon transverse et le mésentère.Remarque : Au cours de cette procédure, le canal cholédoco-pancréatique est ligaturé. Identifier le ligament de gastrosplenic reliant la rate à l’estomac et les courtes branches gastriques, en soulevant l’estomac parotidien et couper avec des ciseaux. Laissez la rate attachée à la prothèse récupérée.Remarque : Afin de réduire le réchauffement du greffon, irriguer le pancréas en permanence l’à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille 19 G avec la solution de perfusion d’histidine-tryptophane-cétoglutarate froide stockée sur la glace. Enfin, supprimer le pancréas du site donneur (Figure 1 b) en saisissant la rate avec une pince et le transférer dans le récipient. Sinon, pour déclencher la lésion de reperfusion de l’ischémie sévère, stocker le greffon dans la solution de perfusion stérile, 4 ° C pendant 16 h avant d’implanter dans l’animal receveur. 2. destinataire préparation Anesthésier l’animal receveur avec une injection intrapéritonéale de xylazine (5 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) à l’aide d’une aiguille de 27 G. Raser la région cervicale latérale droite à l’aide d’un rasoir électrique et placez la souris sur le champ opératoire en position couchée. Difficulté la souris à l’aide de brins de ruban. Évitez de surexploiter les branches avant pour ne pas compromettre la respiration. Frottez le champ opératoire, trois fois à l’aide de gaze imbibé de chlorhexidine. Faire un bon paramedian, incision de la peau légèrement oblique de l’incision, jugulaire à l’angle de la mandibule droite. Sans ménagement, identifier et mobiliser les branches latérales de la veine jugulaire externe droite. Les coaguler avec pince bipolaire et transect eux avec des ciseaux. Soulevez le lobe droit de la glande salivaire submandibulaire parotidien, identifier le pédicule vasculaire et cautériser à l’aide de la pince bipolaire. Enlever le lobe en sectionnant le pédicule cautérisée avec des ciseaux. Par analogie avec l’étape 2.5, identifier toutes les branches médiales de la veine jugulaire externe, les cautériser avec pince bipolaire et transect eux avec des ciseaux.Saper la veine jugulaire externe avec une pince embout incurvé aussi proche que possible et il ligaturer avec ligatures soie deux 8/0, laissant assez d’espace entre les ligatures. La veine jugulaire externe entre les deux ligatures précédemment mis avec des ciseaux droites du transect. Passer l’extrémité proximale de la veine jugulaire externe par le biais de la manchette de polyéthylène (diamètre intérieur de 0,75 mm, diamètre extérieur de 0,94 mm) et fixer les poignées de la collerette avec une pince microhemostat veineuse. Supprimer le lien à la fin de la souche de navire et evert le navire sur le brassard. Difficulté la veine éversée sur le brassard avec une ligature soie circulaire de 8/0 – (Figure 1 a). Dans la partie proximale et distale cautériser la partie superficielle du muscle sternocléidomastoïdien droite, transect il avec des ciseaux et retirez-le. Doucement mobiliser l’artère carotide commune, affaiblir au-dessous de la bifurcation et ligaturer deux fois, en s’assurant ne pas de lier la bifurcation carotidienne. Couper le navire entre les traverses. Semblable à l’étape de 2,9, passez l’extrémité proximale de l’artère carotide commune à travers le brassard polyamide (diamètre intérieur de 0,57 mm, diamètre extérieur de 0,6 mm) et fixer avec une pince microvasculaire artérielle. Enlever la ligature à l’extrémité du moignon vasculaire et élargir doucement la lumière à l’aide de protracteurs de navire. Leonie le navire sur le brassard artériel et fixez-le avec une ligature de soie de 8/0 (Figure 1 a). 3. implantation Place le greffon dans la région du cou du destinataire à l’aide de la rate comme un manche, avec la tête orientée latéralement, la queue y compris la rate en dedans et les souches de bateau direction ventro-caudale. Utilisation des cotons-tiges pour positionner la prothèse correctement. Tirez doucement la veine porte du greffon pancréatique au cours de la veine jugulaire externe le destinataire de l’animal, qui a été précédemment éversée, et fixé sur le brassard approprié (voir étape 2.10). Fixez-le avec une ligature soie circulaire de 8/0. Tirez le moignon de l’aorte abdominale du greffon au-dessus de l’artère carotide commune éversion de l’animal receveur. Fixez-le avec une ligature circonférentielle de soie de 8/0 (Figure 1). Identifier les vaisseaux spléniques près du hile de la rate et affaiblir avec une pince embout incurvé. Attacher avec ligatures soie 8/0 et les vaisseaux spléniques pour enlever la rate du transect. Enfin, raccourcir les liens. Utilisant un application de pinces de serrage, enlevez d’abord la pince sur le brassard veineux. Puis retirez la pince artérielle.Remarque : Si la transplantation a réussi, la greffe du pancréas va être reperfusée montrant immédiatement une couleur rosâtre homogène et la pulsation artérielle visible (Figure 1). Humidifiez la prothèse avec une solution saline normothermique. Retirer la poignée de la manchette veineuse à l’aide de pinces droites. Refermer la plaie chirurgicale avec une course suture 6/0. 4. postopératoire soins (Endpoint) Conformément à la procédure, demander à 0,5 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée (s.c.) pour le remplacement de peropératoire perte de fluide à l’aide d’une aiguille 19 G. Garder l’animal receveur sur un coussin chauffant jusqu’à la guérison complète de l’anesthésie. Une fois réveillé, retourner l’animal receveur de la facilité de logement, où elle peut avoir nourriture et eau ad libitum. Pour éviter la douleur postopératoire, administrer tout de suite après l’opération (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg de poids corporel) toutes les 12 h pour les cinq premiers jours et le carprofène (2) 4 mg/kg de poids corporel toutes les 12 h s.c. pendant la première semaine. Afin d’estimer l’apport nutritionnel adéquat, surveiller le poids (g) de chaque animal receveur tous les jours. Une perte de poids de plus de 10 à 15 % par rapport au poids au jour de la chirurgie, apathie, paralysant, un dos très courbé, ainsi que des infections chirurgicales secondaires représentent les points de terminaison. Dans ce cas, mais aussi après avoir atteint le critère d’évaluation clinique, sacrifier l’animal à l’aide d’inhalation isoflurane terminal.

Representative Results

Durant la dernière décennie, nous avons réalisé plus de 300 greffes du pancréas chez les souris. Après avoir établi le protocole, il y avait une survie globale de > 90 %. Hémorragie postopératoire a été la principale cause de défaillance, suivie de thrombose de prothèse ayant une pancréatite ultérieures greffon nécrotiques létale. Dans les deux cas, les points de terminaison ont été conclus dans les 24h et animaux ont été sacrifiés. Il n’y a pas des troubles neurologiques, des symptômes tels que la dysphagie et des infections chirurgicales secondaires dans cette série. Pour étudier la fonction endocrine des greffons transplantés et donc valider la perméabilité du modèle, une hyperglycémie a été induite chez les souris bénéficiaires par avant le traitement avec une dose unique de streptozotocine appliquée par voie intrapéritonéale (312,5 mg/kg de poids corporel) 4 jours avant la chirurgie. Souris ont été considérés comme hyperglycémiques si la glycémie ont été > 300 mg/dL. Figure 2 a montre le taux de glucose sanguin des différents groupes. Souris ayant reçu des greffes sans un temps d’ischémie froide prolongée de 16 h a atteint normogylcemia dans les 24h après la transplantation et maintient cet état métabolique au cours de la période d’observation tout. En revanche, les animaux non transplantés est resté hyperglycémiques. Comme nous étions intéressés par l’impact d’ischémie reperfusion associés aux blessures greffon dommages sur la fonction endocrine, nous avons ajouté un troisième groupe, où étaient exposés les greffes à temps d’ischémie froide 16 h prolongée (CIT) et 45 min de temps d’ischémie chaude (WIT). Souris recevant ces greffes n’atteignent pas la normoglycémie et devaient être sacrifié après 48 h en raison du développement de la pancréatite grave, qui s’est avérée être mortelle dans ce modèle13. Ce modèle est utile pour divers projets visant à déterminer l’ischémie reperfusion associées aux lésions précoces greffon dommage. D’autres recherches comprenaient, entre autres, la microscopie confocal fluorescence intravitale pour la quantification des troubles microcirculatoires effectué 2 h après la transplantation. Contraste des microvaisseaux des greffons a été amélioré par l’injection de 0,3 mL d’un dextran de fluorescéine isothiocyanate-marqués de 0,4 % (150 000 MW) dans la veine du pénis. Figure 2 b affiche un motif régulier capillaire d’un pancréas murin de naïf et d’une greffe du pancréas transplantée, qui n’était pas exposée à CIT prolongée (Figure 2). En revanche, Figure 2D montre la répartition de la microcirculation en raison d’exposer la greffe du pancréas à cit prolongée. Figure 1 : Photos peropératoires. (A) vue peropératoire des navires bénéficiaires préparé pour l’anastomose. La veine jugulaire externe (1) a été renversée sur la manchette polyéthylène veineux et fixée par une circulaire ligature soie de 8/0. Par analogie, l’artère carotide commune (2) a été renversé et fixé sur le brassard polyamide artériel plus petit. L’échelle bar 1 mm. (B) la greffe du pancréas ex-situ. La veine porte (1) et la souche de l’aorte abdominale (2) nécessaire pour anastomose vasculaire. La rate (3) est récupérée avec le pancréas et est utilisée comme poignée. La rate est supprimée avant la reperfusion du greffon. L’échelle bar 1 cm. vue peropératoire (C) sur les anastomoses. La veine porte (1) est tirée par-dessus le brassard de la veine éversion de la jugulaire externe (2) et fixe avec une cravate de soie de 8/0 circulaire. De même, le moignon aortique de l’aorte abdominale (3) est tiré sur le ballonnet de l’artère carotide commune éversé (4). Balance bar mm 1. vue peropératoire (D) de la greffe du pancréas perfusée après 5 min de reperfusion : après l’ablation de la veine, suivie de la pince artérielle, une greffe du pancréas transplantée avec succès affiche une couleur rosâtre homogène. La rate a été retirée avant la reperfusion (1 : ligaturé navire splénique). L’échelle bar 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Fonction endocrine de la greffe du pancréas et confocale en vivo fluorecence. Figure 2 a montre un graphique en courbes avec des taux de glucose sanguin des souris transplantées sans CIT (n = 10, PTX w/o CIT, ligne bleue), des souris non-transplanté (n = 11, aucun PTX, ligne rouge) et les souris ayant reçu des greffes exposés à CIT prolongée (PTX + 16 h CIT, n = 10, ligne verte). Tous les destinataires ont été précédemment rendues hyperglycémiques avec 312,5 mg/kg de poids corporel par streptozotocine i.p. Tandis que tous les bénéficiaires des greffes sans CIT ont pu survivre à la période d’observation entier (50 jours) avec la fonction endocrine intacte, souris non transplantés est resté hyperglycémiques au cours de la période d’observation tout. Souris ayant reçu des greffes exposées à 16 h CIT n’a pas récupéré de l’hyperglycémie et devaient être sacrifié à 48 h après la chirurgie de transplantation, en raison de la perte de poids de plus de 10 à 15 %. Souris qui survivent à la période d’observation entière ont été sacrifiés à jour 50 après une dernière mesure de la glycémie. Microcirculation en greffons transplantés a été évaluée par microscopie confocal fluorescence intravitale 2 h après la transplantation. Pancréas naïfs ont servi de témoins. Figure 2 b montre un modèle régulier de capillaire dans le pancréas de naïve. On voit aussi un maillage régulier de capillaire dans les greffons transplantés ne pas soumis à la CIT prolongée (Figure 2). En revanche, une ventilation de la microcirculation est observée dans les greffons transplantés exposés à CIT prolongée (Figure 2D). Balance bar 100 µm. les données dans le graphique sont exprimées en ± écart-type. PTX : transplantation de pancréas ; CIT : temps d’ischémie froide ; w/o : sans s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

IRI-associated graft dégâts sont inhérents à la transplantation d’organes solides, et il est caractérisé par une perturbation de la microcirculation. Accumulation de plusieurs métabolites pendant la phase ischémique et initiation de cascades inflammatoires médiée principalement par des espèces réactives d’oxygène et d’azote, entraîne des lésions tissulaires au cours de la greffe reperfusion4. Cette cascade peut compromettre le succès non seulement à court terme, mais aussi à long terme, par conséquent, sensiblement influences et de survie de patients14. A ce jour, une transplantation rénale combinée du pancréas représente la thérapie de choix pour les patients souffrant de type 1 diabète avec fin scène néphropathie15. Plusieurs études ont montré qu’une transplantation de pancréas rein combiné avec succès n’est pas seulement de restaurer et protéger fonction greffe rénale chez les diabétiques, mais stabilise également ou même renverse les complications secondaires, y compris la neuropathie ainsi que micro et macroangiopathie16,17,18.

Malgré des efforts continus de réduction, remplacement et raffinement (3 R) dans la recherche sur les animaux, reproduction de processus physiopathologiques complexes comme l’IRI est simplement impossible dans in vitro des paramètres. Par conséquent, modèles animaux sont toujours considérés comme l’outil idéal pour la recherche translationnelle19,20. Les modèles de souris comme celle décrite ici présentent plusieurs avantages par rapport au rat ou autre animal modèles. Il s’agit de la disponibilité d’une grande quantité de souches de souris consanguines génétiquement bien définie (p. ex. les souches transgéniques et knock-out), une pléthore d’outils d’analyse moléculaire, ainsi qu’un simple et bon marché manutention21. Un avantage majeur du modèle décrit réside dans la technique de suture non brassard. En utilisant la technique présentée ici, les taux de réussite de > 90 % sont réalisables, ce qui est nettement mieux modèles décrits par rapport à précédemment22. En utilisant cette technique non-suture, nous réduit significativement les complications courantes comme un choc hypovolémique, thrombose et une sténose des anastomoses12. Un autre avantage de cette méthode se compose du poste extra abdominal de la prothèse, qui s’accompagne d’une rapide récupération post-opératoire du destinataire. En outre, l’emplacement du col utérin le rend parfaitement adapté aux analyses in vivo , comme l’imagerie direct du greffon par exterioration sans aucune tension22.

Le principal inconvénient de ce modèle est l’occlusion du canal pancréatique, qui ne ressemble pas à la réalité clinique. Dans ce modèle, drainage exocrine est géré en liant la cholédoco-pancréatique. À long terme, cela se traduit par une fibrose marquée et l’atrophie de la glande sans zéro de greffer la pancréatite22. En raison de cette détérioration du tissu exocrine, que nous avons observé plus tôt car à 30 jours après la transplantation, nous croyons que ce modèle n’est pas adapté pour l’observation de longue durée. En revanche, la fonction endocrine irréprochable fait gylcemic contrôles du bénéficiaire un outil facile pour évaluation quotidienne de la fonction du greffon13,23,24.

Ces caractéristiques en fait un modèle idéal pour l’analyse des blessures de greffon début associée liés longues périodes de conservation ou à des techniques et solutions de conservation différents. Pour obtenir des résultats optimaux avec ce modèle, on doivent considérer plusieurs étapes cruciales. Le pancréas lui-même est très sensible à la manipulation. Par conséquent, manipulation douce à l’aide de bâtonnets de coton pendant la restauration de l’orgue et Pendant l’implantation minimise trauma mécanique. Saisie directe de la glande avec une pince il faut éviter, car il en résulterait inévitablement des dommages sévères greffon. Pour la même raison, la rate est récupérée avec le pancréas et est utilisée comme poignée. Il est également établi dans la pratique clinique. Un autre écueil consiste à perfusion froide, qui est réalisée par la perfusion par le moignon aortique en utilisant la solution de perfusion de l’histidine-tryptophane-cétoglutarate de 4 ° C. Par la présente, un gonflement excessif de la glande peut être évité en perfusant doucement le greffon. Trace de la solution de perfusion devrait être utilisé pour humidifier la greffe, afin de maintenir sa température basse pendant la restauration de l’orgue.

En ce qui concerne la préparation bénéficiaire une dissection minutieuse de la veine jugulaire externe, ainsi que l’artère carotide commune définit la base pour la revascularisation réussie. En particulier, complète l’exposition de la veine en supprimant non seulement tous les affluents, mais aussi le tissu graisseux environnant, est nécessaire afin d’éviter la compression externe et sténose de tissu graisseux restant. La sélection des diamètres des rotateurs approprié est essentielle. Basé sur l’expérience partagée, pour souris pesant entre 25 à 28 g, diamètre intérieur de 0,57 mm pour le brassard artériel et entre 0,75 et 0,8 mm pour le brassard veineux, est approprié. Précis, propre découpage des bords des poignets est obligatoire pour éviter de déchirer le moignon de navire. Dilatation des vaisseaux, en particulier de l’artère, est obtenue meilleures en utilisant protracteurs navire avec des pointes fines. En règle générale, le navire devrait pouvoir élargir à deux fois la lumière de la manchette. Au cours du processus d’inverser le navire au-dessus et en le fixant sur le brassard, nous vous recommandons de stabilisation clamps vasculaires en les plaçant sous un lambeau de peau, car cela facilite cette étape cruciale.

Comme nous l’avons déjà mentionné, la suture non brassard-technique représente une méthode facile pour anastomose vasculaire et peut être effectuée en moins de 5 min. Toutefois, un positionnement correct de la prothèse dans la région du cou du destinataire est primordial pour la revascularisation correcte. Par la présente, le final bon positionnement de la prothèse dans la région du cou doit être prévu afin de permettre une anastomose sécuritaire, droite et sans tension de l’artère et la veine. Les navires qui sont trop longues doivent être évités, car cela peut conduire à l’obstruction de la sortie en raison de la déformation. Pour la même raison, la poignée en manchette à l’anastomose veineuse doit également être retirée après la reperfusion. En cas d’hémorragies localisées de la greffe du pancréas, hémostase réussie est possible en compressant doucement le côté de saignement pendant 5 min à l’aide de cotons. C’est le seul moyen pour gérer ce genre de complication.Cautérisation, quoique très sélective, résulté en une perte de greffon dans presque tous les cas, à cause de pancréatite nécrotique.

En résumé, nous avons développé une méthode pour la transplantation du pancréas chez la souris à l’aide d’une technique de suture non brassard, qui est techniquement faisable et microchirurgicalement et a un taux de réussite excellent. Étant donné la fibrose progredient du pancréas due à l’occlusion du conduit, ce modèle convient mieux pour des domaines de recherche se concentrant sur les premiers dommages de greffon. Ce manuscrit est destiné à permettre aux chercheurs d’établir en toute sécurité ce modèle dans leurs laboratoires.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions 2008-1-596 # et #UNI-0404/1956 de la « Tiroler Wissenschaftsfonds (TSF) » (https://www.tirol.gv.at/en/) et par grant #2013-042018 de la « Förderungsprogramm MUI-Start » de l’Université de Innsbruck médical.

Materials

Adventitia Scissors S&T S-00102 Straight
Dumont # 7 Forceps FST  11271- 30 Curved Tip 0.17 x 0.1 mm
Yasargil Clip Mini Permanent 7mm Aesculap FE720K
Micro vessel clip S&T B1 00396 V
Vessel dilatator S&T D-5a.2, 00125
Clip applier S & T CAF-4 00072 for venous cuff
Clip applier Aesculap FE572K  for the arterial cuff
Polyethylene tube Portex Ltd Inner diameter 0.75 mm for venous cuff
Polymide tubing Vention Medical  141-0051 Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd)
Polymide tubing Vention Medical 141-0033 Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff
Bipolar forceps Micromed 140-100-015
8/0 silk ligatures Catgut GmbH, Merkuramed 17209008
Custodiol HTK solution Dr. Franz Köhler Chemie 59997
Ketamin Graeub aniMedica GmbH 32554
Xylasol Graeub aniMedica GmbH 50855
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Gruessner, A. C. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).
  2. Troppmann, C. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).
  3. Fernández-Cruz, L., et al. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).
  4. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  5. Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).
  6. Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).
  7. Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).
  8. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753 (2014).
  9. Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).
  10. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).
  11. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).
  12. Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).
  13. Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).
  14. Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).
  15. White, S., Shaw, J., Sutherland, D. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).
  16. Morath, C., et al. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).
  17. Perseghin, G., et al. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).
  18. Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65 (1998).
  19. Kirk, A. D. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).
  20. de Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?–Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).
  21. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  22. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
  23. Cardini, B., et al. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570 (2014).
  24. Maglione, M., et al. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).

Tags

Mouse ModelPancreas TransplantationModified Cuff TechniqueKetamineXylazineMidline LaparotomyHeparinAbdominal AortaCommon Bile DuctPortal VeinRenal VeinCeliac TrunkAortic PatchPerfusion SolutionDuodenumLigament Of Treitz

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. R., Eiter, R., Hermann, M., Kofler, M., Schneeberger, S., Brandacher, G., Maglione, M. Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique. J. Vis. Exp. (130), e54998, doi:10.3791/54998 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image