Presentamos un modelo de lesión en la médula espinal basado en el desplazamiento del tejido que puede producir una lesión consistente de la médula espinal contusa en ratones adultos.
La producción de una lesión de la médula espinal contundente y reproducible es esencial para minimizar las variabilidades de comportamiento e histológicas entre los animales de experimentación. Se han desarrollado varios modelos de SCI contusivos para producir lesiones utilizando diferentes mecanismos. La gravedad de la LME se basa en la altura en la que un peso dado se deja caer, la fuerza de lesión o el desplazamiento de la médula espinal. En el presente estudio, introducimos un nuevo dispositivo SCI contusivo de ratón, el impacto de LISA (Louisville Injury System Apparatus), que puede crear un SCI basado en el desplazamiento con una alta velocidad y exactitud de las lesiones. Este sistema utiliza sensores de distancia láser combinados con software avanzado para producir lesiones graduadas y altamente reproducibles. Se realizó un SCI contusivo en el nivel de la 10ª columna vertebral torácica (T10) en ratones para demostrar el procedimiento paso a paso. El modelo también se puede aplicar a los niveles cervicales y lumbares espinales.
La lesión de la médula espinal más común (SCI) que ocurre en los seres humanos es una contusiva SCI 1 . Para investigar los mecanismos de lesión y las diversas estrategias terapéuticas después de la LME, se necesita un modelo SCI contuso, preciso, consistente y reproducible en roedores.
Muchos modelos de lesión contusiva de la médula espinal con diversos mecanismos productores de lesiones se han utilizado en la investigación experimental de SCI 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Tres impactantes modelos SCI -específicamente, el peso de impacto de la Universidad de Nueva York (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor 3 , 6 , la Universidad del Estado de Ohio (OSU) impactor / dispositivo electromagnético SCI (ESCID) 7 , unD el impactador del Horizonte Infinito (IH) 4 , 8 – son ampliamente aceptados en el campo de investigación de SCI. El impactador NYU / MASCIS o un equivalente produce lesión al bajar un peso fijo de diferentes alturas a la médula espinal objetivo para crear múltiples gravedad de lesiones 3 , 6 . El OSU / ESCID causa lesión induciendo el desplazamiento del tejido 5 , 7 . El impactador IH produce lesiones aplicando diferentes fuerzas a la médula espinal 4 , 8 . Cada impactador utiliza una velocidad diferente, que es un parámetro importante que influye en los resultados de la lesión. El aparato NYU / MASCIS genera velocidades que van desde 0,33-0,9 m / s. El dispositivo IH tiene una velocidad máxima de 0,13 m / s 4 . El impactador OSU / ESCID tiene una velocidad fija de 0,148 m / s 5 . En particular, las velocidadesSe modelos son más bajos que el observado en las velocidades clínicas, que por lo general exceden 1,0 m / s [ 9] .
Aquí, introducimos un nuevo dispositivo SCI contusivo basado en el desplazamiento, denominado LISA (Louisville Injury System Apparatus), para producir SCI en ratones con una alta velocidad de impacto 10 . Este sistema incluye un estabilizador vertebral, que estabiliza firmemente la vértebra en el sitio de la lesión, permitiendo la producción de un SCI constante y reproducible. El sensor láser del dispositivo asegura la determinación precisa del desplazamiento del tejido y la gravedad resultante del SCI. La velocidad del émbolo en el punto de contacto con la médula espinal puede ajustarse de 0,5 a 2 m / s. Estos parámetros de lesión reproducen estrechamente la SCI traumática vista clínicamente.
En 1911, Allen describió el primer modelo de caída de peso usando un peso fijo para inducir lesiones en las médulas espinales expuestas de los perros 12 . Se han desarrollado modelos de caída de peso similares basados en el modelo Allen, incluyendo el impactador NYU / MASCIS 3 , 6 , 13 , 14 . Además del modelo de caída de peso, se han creado otros dispositivos SCI. El modelo OSU / ESCID 5 , 7 utiliza un mecanismo de desplazamiento del tejido para controlar la gravedad de las lesiones, y el modelo IH 4 , 8 utiliza la fuerza para crear un SCI graduable. En estos sistemas, la estabilización vertebral se obtiene sujetando los procesos espinosos rostrales y caudales al sitio de la lesión. Estos dispositivos utilizan velocidades de lesiones bajas, específicamente 0,33-0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),Y 0,13 m / s (1H). La estabilización de los procesos espinosos rostrales y caudales puede causar flexibilidad de la columna vertebral y movimiento de la columna durante el impacto, lo que puede afectar la precisión de la lesión.
El método LISA intenta superar las deficiencias de los modelos existentes, particularmente en lo que respecta a la inestabilidad de la columna vertebral y la baja velocidad de lesión. Este método utiliza bilateral facet estabilización y evita los artefactos de movimiento asociados con la lesión. Este dispositivo utiliza una velocidad de alto impacto que puede establecerse entre 0,5-2 m / s 11 , 15 . El sensor láser es más avanzado que el Vibrador Ling utilizado en el modelo ESCID y mide con precisión la distancia desde la superficie de la médula espinal sin necesidad de contacto tisular. El modelo se desarrolló originalmente para producir un SCI de rata, y ahora se ha adaptado para producir SCI en ratones y en primates no humanos 16 , con modificaciones.
Columna vertebralAbilization reduce la variabilidad en todos los métodos experimentales de SCI, particularmente en modelos del desplazamiento del tejido. El sensor de distancia láser determina la magnitud del desplazamiento tisular de la médula espinal durante los movimientos respiratorios. Es importante que el punto de la médula espinal en el que se centra el láser debe ser el punto idéntico golpeado por el impactador. Esta etapa se realiza durante la etapa de calibración ( Figura 3 ), cuando la punta del impactador y el haz láser están alineados. Una debilidad potencial de este modelo es que la magnitud del desplazamiento tisular se mide desde la superficie dural. Aunque el grosor de la duramadre constituye una diferencia insignificante entre los animales, puede existir variabilidad significativa en el espacio subaracnoideo lleno de líquido cefalorraquídeo (LCR). La variabilidad en los resultados de las lesiones puede ocurrir al producir una lesión de contusión muy leve usando un pequeño desplazamiento del tejido. En general, la consistencia de la lesión depende principalmenteSobre la precisión del desplazamiento del tejido y también sobre la velocidad y el tiempo de contacto con el tejido del émbolo.
El rango de desplazamiento tisular es amplio (precisión: 0-10 ± 0,005 mm). Sobre la base de datos experimentales previos e información publicada en roedores y primates no humanos, un desplazamiento del 20% del diámetro anteroposterior del SC produce un SCI leve, un desplazamiento del 30-40% produce un SCI moderado y un desplazamiento> 50% Produce SCI severa a una velocidad de 1 m / s. Habrá ligeras diferencias dependiendo de la especie animal. El tiempo de parada es ajustable de 0 a 5 s con un relé de tiempo. En nuestro estudio, el tiempo de permanencia se estableció en 300 ms. Esto se puede ajustar fácilmente para reproducir los tiempos de permanencia de otros dispositivos SCI, incluyendo los modelos NYU e IH.
En resumen, hemos desarrollado un modelo basado en el desplazamiento de SCI contusiva en ratones adultos. El modelo utiliza un estabilizador en forma de U para estabilizar las facetas espinales bilaterales, evitando el cordónArtefactos de movimiento asociados con la medición guiada por láser de la superficie del cordón. Este modelo puede producir lesiones de la cuerda de alta velocidad de 0.5-2 m / s. El sensor láser es más preciso que el método convencional para determinar la velocidad y la distancia a la superficie de impacto. El modelo puede producir lesiones de la médula espinal en todos los niveles, de leve a severo. Cuando se modifica, este dispositivo también puede producir lesiones en ratas y animales grandes, tales como primates no humanos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; Premio al Examen del Mérito I01 BX002356 del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos; Fundación Craig H Neilsen 296749; Fundación Indiana para Investigación de Lesiones Cerebrales y Médula Espinal y Fondos de Dotación Mari Hulman George (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); El Estado de Indiana ISDH 13679 (XW); Y la Fundación NeuroCures.
Ketamine (7.2mg/ml)/Xylazine (0.475mg/ml)/Acepromazine | Patterson Veterinary | 07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947 | Anesthetic agent |
Buprenorphine(0.03mg/ml) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | antibiotic agent |
Purdue Products Betadine Surgerical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | for sterilizing skin |
Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | for sterilizing skin |
Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | for sterilizing skin |
1ml NORM-JECT | HENKE SASS WOLF | D-78532 | for anethesia/pain relief/antibiotic agent injection |
10ml Syringe | TERUMO | REF SS-10L | for saline injection |
Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | provent eyes from dry |
Antiobiotic Ointment | Webster Veterinary | 07-877-0876 | provent surgery cut from infection |
Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | stop bleeding |
Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | grasp tissue |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
Scalpel Blade #15 | Fisher Scientific | 10015-00 | skin cut |
Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | stop bleeding |
Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | keep the surgery view open |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14040-10 | for muscle seperated from spine |
Sterile sutures | Fine Science Tools | 12051-10 | skin closure |
Mouse Vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | N/A | Stabilize and expose the vertebra |
LISA | Louisville Impactor System | N/A | Produce an experimental contusion injury of the spinal cord in mice |