أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر
Summary
Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Abstract
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Introduction
وقد استخدم مضان المجهر منذ فترة طويلة لدراسة آثار الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي الزرد، لا سيما آثارها على التنمية 1. وقد سمح عالية الدقة المجهر على خرائط تفصيلية لعمليات الخلوية العاملة في مجال التنمية في الدماغ، وتوليد العضلات، والعديد من الفعاليات التنموية الأخرى 2. كان يدرس وفاة خلية فردية أكثر تحديا، ويرجع ذلك أساسا إلى الصعوبات التقنية لاستحثاث موت الخلايا انتقائية خلال إجراءات التصوير القياسية. ومع ذلك، فإن الجمع بين وحيدة الخلية القرار التصوير والتقنيات الاجتثاث المستهدفة للغاية يسمح التحقيق في الاستجابات الخلوية فورية للإجهاد والإصابات، وكذلك التفاعلات خلية خلية يترتب على ذلك. فهم هذه العمليات أمر بالغ الأهمية، وخاصة للأمراض العصبية مثل مرض العصبون الحركي (الفرقة المتعددة الجنسيات)، التي يتبين فيها أن التفاعلات العصبية، الدبقية للمساهمة في تقدمالمرض 3.
القوات المتعددة الجنسيات، أو العضلية التصلب الجانبي (ALS)، هو مرض الاعصاب المدمر الذي يؤثر على الخلايا العصبية الحركية في الدماغ، القشرة الحركية، والحبل الشوكي. فقدان هذه الخلايا العصبية يؤدي إلى فقدان العضلات، والمرضى يموتون خلال 3-5 سنوات من التشخيص 4. الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي وصلة لألياف العضلات وتلعب دورا أساسيا في تسهيل تقلص العضلات. فشل هذه الاتصالات أو موت هذه الخلايا العصبية تضعف تدريجيا العضلات ويؤثر على قدرة المريض على ابتلاع، المشي، الكلام، والتنفس. تصور وفاة الخلايا العصبية الحركية والعواقب على المدى القصير في الحيوانات الحية يوفر فرصة ممتازة لفهم أفضل للعمليات الحيوية تشارك في التوازن الطبيعي للخلايا والمرض.
ظهرت الزرد كنظام نموذجا جذابا لدراسة أمراض الاعصاب 1. هذهويرجع ذلك إلى المزايا التي يوفرها هذا الكائن نموذج، مثل الإخصاب الخارجي، وقت التنموية قصيرة، والوصول البصري للجهاز العصبي، وسهولة transgenesis. وبالإضافة إلى ذلك، والقدرة على توليد بسهولة الزرد المعدلة وراثيا مركب تسمح لاستراتيجيات وضع العلامات متعددة من أنواع مختلفة من الخلايا. النهج الاجتثاث وراثي لقتل أنواع معينة من الخلايا تسمح اضطراب واسع نوعا ما، ولكنها تفتقر إلى مراقبة دقيقة من استهداف الخلايا الفردية 5. تقنيات بمساعدة الليزر، من ناحية أخرى، توفر السيطرة الزمانية والمكانية الجميلة واستخدمت لنماذج حيوانية مختلفة. في حين أن معظم نهج استخدام المعدات المتخصصة، مثل نابض الليزر 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12 أو اثنين الفوتون مجموعة عمليات 13، وغيرهااتخذت المجموعات البحثية مؤخرا ميزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية في المجاهر متحد البؤر التقليدية 14.
تقنية الموضحة هنا يجمع عالية الدقة متحد البؤر المجهري مع نهج بوساطة الليزر فوق البنفسجية أن تسبب الإجهاد الخلوي أو الوفاة بطريقة تعتمد على الجرعة في الخلايا العصبية الحركية المحدد. وهي تعتمد على استخدام تثبيت عادة ليزر 405 نانومتر، وقد اختبرت بنجاح في زراعة الخلايا والحيوانات الحية، ويسمح توصيف مفصل من التفاعلات الخلوية، مثل إزالة دبقية بعد وفاة الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج ليزر تذرية
تقنيات الاجتثاث بمساعدة الليزر تسمح استهداف دقيق للمجموعات فردية أو صغيرة من الخلايا. الجمع بين هذه التقنية مع عالية الدقة المجهر والتلاعب الجيني في النماذج الحيوانية مثل الزرد يسمح للباحثين لدراسة منهجية مصير خلية فردية والتفاعلات بعد تعافيه من الاصابة.
الأشعة فوق البنفسجية (405 نانومتر) بروتوكول الاستئصال بالليزر الموصوفة هنا يوضح كيف الخلايا الفردية يمكن التشديد أو قتل انتقائي (بطريقة تعتمد على الجرعة)، في حين المجاورة الخلايا العصبية، الدبقية، وتترك محاور عصبية دون أن يصاب بأذى. لقد استخدمت بنجاح هذا النهج في تجارب زراعة الخلايا وهنا وصف نهج مفصل عن الحبل الشوكي الزرد. نقدم لك مجموعة من تنفيذ هذا النهج في الحبل الشوكي الزرد بالتشديد بشكل انتقائي على الخلايا العصبية الفردية ضمن شبكة من الخلايا الأخرى (الشكل 5، A و <strong> B)، أو عن طريق قتل الخلايا العصبية واحدة على الفور ودون الانتعاش (الشكل 5 و C و D).
سابقا، نظم الليزر المتخصصة، مثل ليزر نابض النيتروجين أو أنظمة ليزر ثنائي الفوتون كان مطلوبا، للحث على تلف الأنسجة وtransections 10، 11، 12، 13 العصب المحرك. وقد تم استخدام أنظمة ليزر هذه بنجاح أن تسبب تلف الخلايا، مثل الجلطة في الشرايين والأوردة 6، قصور كلوي حاد 7، وإصابة القلب 8، ودراسة موجات الكالسيوم والاستجابة دبقية بعد إصابات الدماغ 9. وعلاوة على ذلك، تستخدم Soustelle وزملاؤه الإعداد متحد البؤر التقليدية (351 نانومتر و 364 نانومتر ليزر الأشعة فوق البنفسجية) للحث على الأضرار التي لحقت الظهارية وخلايا الدبقية في ذبابة الفاكهة 14 </ سوب>.
أهمية نماذج الزرد لفهم ALS (والأمراض البشرية الأخرى)
الزرد هي نموذج المستخدمة على نطاق واسع الحي، وخاصة بالنسبة للدراسات التنموية 28، 29، 30. بينما لديهم بعض القيود، قدرتها على نموذج الأمراض التي تصيب البشر وإعطاء فهم الآليات الجزيئية المسببة للأمراض هائلة. تم راسخة نماذج الزرد لدراسة الفرقة المتعددة الجنسيات وأدت إلى رؤى الجزيئية المهمة 31، 32، 33، 34. خطوط الزرد المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد بسرعة (4-5 أشهر)، والسماح للتتبع انتقائي من نوع خلية معينة، الميزات التي تجعلها إضافة قيمة إلى النماذج الحيوانية الحالية من المرض. الأجنة الزرد / اليرقات شفافة بصريا وتقدم من experi فريدة من نوعهاالمزايا العقلية التي تسمح الحية التصوير على المدى الطويل على مستوى وحيدة الخلية في الدماغ أو الحبل الشوكي، والتي لا يمكن أن يتحقق بسهولة في نماذج القوارض (أو في البشر). عندما جنبا إلى جنب مع التقنيات الجزيئية، مثل الاجتثاث وحيدة الخلية، وهذا يوفر منصة تجريبية فريدة لدراسة الآليات الجزيئية الدقيقة في الجسم الحي.
الخلايا العصبية الحركية يمكن انتقائي المستهدفة عن طريق الأشعة فوق البنفسجية ليزر تذرية
الخلايا العصبية في العمود الفقري في الزرد تبدأ في تطوير في غضون 10 ساعة بعد الولادة، وأنشأت بعد حوالي 48 ساعة 35 و 36. يسمح هذا التطور السريع التصور من هذه الخلايا العصبية في فترات زمنية قصيرة ومع إنتاجية عالية. توفر الخلايا العصبية الحركية على الرابط الأساسي بين الدماغ والعضلات و، في ALS، تتأثر في القشرة الحركية (الخلايا العصبية الحركية العليا)، والدماغ، والحبل الشوكي (أقل الخلايا العصبية الحركية). فقدان هذه الخلايا العصبية يؤدي حتما إلى موضمور scle والضعف. الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي من الزرد يمكن تحديد توقعاتهم متميزة وعن استخدام المروجين محددة الحركية العصبية مثل -3MNX1. استهداف سوما خلية من هذه الخلايا العصبية إسقاط كشفت انحطاط تقدمي على إسقاط محور عصبي مع مرور الوقت (الشكل 4 و فيديو 1). وحيدة الخلية القرار التصوير من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري وأكدت بالإضافة إلى ذلك النبات فسفاتيديل ويترتب على ذلك Annexin V وضع العلامات بعد الاستئصال بالليزر (انظر الشكل 4 و فيديو التكميلية 3 في مرجع 27). على الرغم من أننا تقريرا تفعيل Annexin الخامس في الموت الخلايا العصبية بعد نهجنا الاجتثاث للأشعة فوق البنفسجية ليزر، ونحن لا نستطيع أن نجزم بأن تتالي الموت التي يتم تشغيلها أثناء هذه العملية المتسارعة يطابق تماما وفاة الخلايا العصبية الذي يحدث أثناء التنكس العصبي أو التوازن الطبيعي للخلايا.
في حين أن هذا النهج الاجتثاث هو تكرار للغايةو، استراتيجيات محددة التضمين مختلفة قد تؤثر أيضا على كفاءة الاجتثاث للأشعة فوق البنفسجية. في تجربتنا، وكان الأكثر نجاحا للحد من طبقة من الاغاروز نحن جزءا لا يتجزأ من الأسماك لدينا في. طبقات سمكا من تضمين المتوسطة مع طبقة إضافية من المياه البيض قد يقلل من قوة الأشعة فوق البنفسجية الواردة في نهاية المطاف من قبل الخلية بسبب التوهين وتناثر الآثار التي تحدث على طول مسار الشعاع.
في المستقبل، سوف عبور خطوط مختلفة الأسماك المعدلة وراثيا يسمح للتصور على المدى القصير فورا و(تصل إلى 12 ساعة) استجابات الخلايا المتضررة الأخرى، مثل الدبقية، إلى تدمير الخلايا التي يسببها الليزر. على سبيل المثال، كانت نجمية وغير الخلية سمية مستقلة في الاضطرابات العصبية مثل اعتلال الأعصاب الحركية في دائرة الضوء البحوث وتورط بشكل كبير في تسببها متفرقة والعائلية ALS 37 و 38. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة سمية الدبقية والانتقائيةنحو المحرك تبقى الخلايا العصبية واضحة. نحن وغيرنا جرت مؤخرا ميزة هذا النهج لدراسة ابتلاع الموت الخلايا العصبية بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة وتصور لإزالة مخلفات العصبية 27، 39، 40.
والجمع بين تقنية الاجتثاث مع عالية الدقة المجهر وعلامات لneuroinflammation تسمح للباحثين في المستقبل لتوسيع فهم وظيفة وحيدة الخلية ونظم خلايا مترابطة. توصيف هذه العمليات في الإعداد في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية ليس فقط في إعدادات التنموية ولكن أيضا في نماذج من الأمراض العصبية، بما في ذلك القوات المتعددة الجنسيات، حيث قد تنخفض قيمته التفاعلات الخلوية 3، 41.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Materials
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referenzen
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish — emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
