Срабатывание клеточный стресс и смерть с использованием обычных УФ-лазера конфокальной микроскопии
Summary
Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Abstract
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Introduction
Люминесцентной микроскопии уже давно используется для изучения влияния трансгенов в данио ЦНС, в частности , их влияние на развитие 1. Микроскопии высокого разрешения позволило детальное отображение клеточных процессов , участвующих в развитии мозга, формирование мышц, и многих других мероприятий в области развития 2. Изучение смерти отдельной клетки была более сложной, в основном из-за технических трудностей индукции селективной клеточной гибели при выполнении стандартных процедур обработки изображений. Тем не менее, сочетание изображений разрешением одноклеточных и высокой релевантностью методов абляции позволяет исследовать непосредственные клеточные реакции на стресс и травмы, а также из последующих межклеточных взаимодействий. Понимание этих процессов имеет решающее значение, в особенности для нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь двигательного нейрона (БДН), где нейрон-глиальных взаимодействий, как было показано способствовать прогрессированиюболезни 3.
БДН, или боковой амиотрофический склероз (БАС), является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое влияет на моторные нейроны в стволе головного мозга, моторной коры и спинного мозга. Потеря этих нейронов приводит к потере мышечной массы, и пациенты умирают в течение 3 – 5 лет после установления диагноза 4. Моторные нейроны в связи спинного мозга мышечных волокон и играют существенную роль в обеспечении сокращения мышц. Несоблюдение этого сообщения или смерти этих нейронов постепенно ослабляет мышцы и влияет на способность пациента глотать, ходить, говорить и дышать. Визуальное смерть мотонейрона и краткосрочные последствия в живом организме животного дает прекрасную возможность лучше понять динамические процессы, связанные с нормальным клеточного гомеостаза и болезни.
Данио появились как привлекательная модель системы для изучения нейродегенеративных заболеваний 1. Этаиз-за преимуществ, предлагаемых этой модели организма, такие как внешнее оплодотворение, короткое время развития, оптический доступ к нервной системе, а также простоты трансгеноза. Кроме того, способность легко генерировать соединение трансгенного данио позволяет несколько стратегий маркировки различных типов клеток. Генетическая абляция подходы , чтобы убить конкретные типы клеток позволяют довольно широкое возмущение, но им не хватает тонкой регулировки ориентации отдельных ячеек 5. С помощью лазера методы, с другой стороны, обеспечивают точную временную и пространственный контроль и были использованы для различных моделей на животных. В то время как большинство подходов используют специализированное оборудование, такие как импульсные лазеры 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или Двухфотонное Наладки 13, другойисследовательские группы недавно воспользовались УФ – лазером в обычных микроскопов софокусных 14.
Техника, описанная здесь сочетает в себе с высоким разрешением конфокальной микроскопии с лазерным опосредованную подход УФ, чтобы вызвать клеточный стресс или смерти в зависимости от дозы в отдельных двигательных нейронов. Он основан на использовании широко установленной 405-нм лазер, был успешно испытан в клеточной культуре и в живых животных, а также позволяет подробную характеристику клеточных взаимодействий, таких как микроглии клиренс после гибели нервных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лазерная абляция подходы
С помощью лазера методы абляции позволяют точное нацеливание индивидуальных или небольших групп клеток. Комбинируя эту технику с высокой разрешающей способностью микроскопии и генетических манипуляций на животных моделях, таких как данио позволяет исследователям систематически изучать судьбу отдельной клетки и взаимодействия после травмы.
УФ (405 нм), протокол лазерной абляции, описанный здесь описывается, как отдельные клетки могут быть подчеркнуты или убиты избирательно (в зависимости от дозы), в то время как соседние нейроны, глиальные клетки, и аксоны остаются невредимыми. Мы успешно использовали этот подход в экспериментах на клеточных культурах и описать здесь детальный подход к данио спинного мозга. Покажем реализацию этого подхода в данио спинного мозга избирательно подчеркивая индивидуальный нейрон в сети других клеток (рисунок 5, А и <strong> В), или убивая одного нейрон немедленно и без восстановления (рисунок 5, C и D).
Ранее специализированные лазерные системы, такие как лазер импульсного азота или лазерных систем двухфотонных, должны были вызвать повреждение тканей и двигательного нерва transections 10, 11, 12, 13. Эти лазерные системы были успешно использованы , чтобы привести к повреждению клеток, таких как тромбоз в артерий и вен 6, острое повреждение почек 7, сердечной травмы 8, а также изучить волны кальция и микроглии ответ после травмы головного мозга 9. Кроме того, Сустель и его коллеги использовали обычную установку конфокальной (351 нм и 364 нм УФ – лазеров) , чтобы вызвать повреждение эпителиального и глиальных клеток у дрозофилы 14 </ SUP>.
Актуальность Zebrafish моделей для понимания ALS (и других заболеваний человека)
Рерио являются широко используемой моделью организма, особенно для исследований в области развития 28, 29, 30. В то время как у них есть определенные ограничения, их потенциал, чтобы моделировать заболевания человека и дать понимание патогенных молекулярных механизмов огромен. Рыбок данио модели были хорошо созданы для изучения БДН и привели к важным молекулярными прозрений 31, 32, 33, 34. Трансгенные данио линии могут быть быстро генерируются (4 – 5 месяцев) и позволяют селективную отслеживание определенного типа клеток, особенности, которые делают их ценным дополнением к текущим моделям животных АЛС. Эмбрионы рыбок данио / личинки являются оптически прозрачными и предлагают уникальный Experiпсихические преимущества, которые позволяют долгосрочное живого создания образа на уровне одной клетки в головном мозге или спинном мозге, который не может быть легко достигнуто в моделях грызунов (или в организме человека). В сочетании с молекулярными методами, такими как одноклеточного абляции, это обеспечивает уникальную экспериментальную платформу для изучения точных молекулярных механизмов в естественных условиях.
Двигательными нейронами могут быть Избирательно Targeted Использование УФ лазерной абляции
Нейронов спинного мозга в данио начинают развиваться в течение 10 ч после рождения и устанавливаются приблизительно через 48 ч 35, 36. Такое быстрое развитие позволяет визуализацию этих нейронов в короткие сроки и с высокой пропускной способностью. Моторные нейроны обеспечивают необходимую связь между мозгом и мышцами и, в БАС, поражаются в моторной коре (верхние моторные нейроны), ствола головного мозга и спинного мозга (нижние моторные нейроны). Потеря этих нейронов неизбежно приводит к мюSCLE атрофия и слабость. Двигательные нейроны в спинном мозге данио могут быть идентифицированы по их различных проекций и использованием мотор-нейрон конкретных промоутеров , как -3MNX1. Ориентация клеток сомы таких нейронов выступающими выявили антероградную вырождение вдоль аксонов проекции с течением времени (рис 4 и видео 1). Одноклеточный разрешение визуализации спинальных двигательных нейронов дополнительно подтвердили транслокацию фосфатидилсерина и последующее аннексина V-маркировки после лазерной абляции (смотри рисунок 4 и Дополнительное видео 3 в 27). Хотя мы сообщаем об активации аннексина V в смерти нейронов после нашего УФ лазерной абляции подхода, мы не можем быть уверены, что каскад смерти, который запускается в течение этого ускоренного процесса, точно соответствует гибели нейронов, которая происходит во время нейродегенеративных или нормального клеточного гомеостаза.
Хотя это абляция подход очень воспроизводимыеи конкретные, различные стратегии вложения также могут влиять на эффективность УФ-абляции. По нашему опыту, это было самым успешным, чтобы минимизировать слой агарозы мы внедренного нашу рыбу. Более толстые слои вложение среды с дополнительным слоем яичного воды может привести к снижению мощности УФ излучения, в конечном счете, полученную клеткой вследствие затухания и эффектов рассеяния, которые происходят вдоль пути луча.
В будущем, пересечение различных трансгенных рыб линий позволит визуализации немедленного и краткосрочных (до 12 ч) ответы других пораженных клеток, таких как глии, к разрушению лазериндуцированной клеток. Например, астроциты и не-клеток автономной токсичности при нейродегенеративных расстройств , таких как БАС были в научно – исследовательском центре внимания и в значительной степени участвуют в патогенностью спорадической и семейной ALS 37, 38. Однако механизмы, лежащие в основе глиальных токсичности и селективностик двигателю нейроны остаются неясными. Мы и другие недавно воспользовались этим подходом к изучению полном охвате смерти нейронов путем микроглии и визуализировали клиренс нейрональных остатков 27, 39, 40.
Сочетание техники абляции с микроскопии высокого разрешения и маркеров для нейровоспаления позволит исследователям в будущем расширить понимание функции одноклеточных и взаимосвязанных клеточных систем. Характеристика этих процессов в обстановке в естественных условиях имеет решающее значение не только в условиях развития , но и в моделях нейродегенеративных заболеваний, в том числе БДН, где клеточные взаимодействия могут быть нарушены 3, 41.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Materials
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referenzen
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish — emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
