Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em> In Vitro</em

Estudando interações proteína-proteína de membrana-proximal é uma tarefa desafiadora devido à dificuldade de recapitular o ambiente nativo das proteínas de membrana integrais envolvidas ^1. Isto é devido à necessidade de solubilização detergente e a orientação inconsistente de proteínas em proteolipossomas. A fim de evitar estes problemas, que têm empregue uma estratégia em que os domínios solúveis de proteínas de membrana integrais são expressos como proteínas de fusão His-tag, e estes fragmentos solúveis estão ancoradas aos lipossomas através de interacções de andaime com NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups no lípido superfície. Usando estes andaimes, as interacções proteína-lipídicos proximal pode ser investigada através de uma gama de composições de lípidos e proteínas.

Temos eficazmente aplicado esse método para investigar as interacções proteína-proteína crítica que governam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e examinar interacções lípidos que modulam este processo ^2. Durante fissão mitocondrial, uma proteína de remodelação da membrana conservada, chamada proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1) ^3, é recrutado para a superfície do mitocondrial externa da membrana (OMM) em resposta a sinais celulares que regulam a homeostase de energia, sinalização apoptótica, e vários outros processos mitocondriais integral. Esta grande GTPase, citosólica é recrutada para a superfície das mitocôndrias através de interacções com proteínas integrais OMM ^{4 – 8.} O papel de uma tal proteína, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), tem sido difícil para elucidar devido a uma interacção fraca aparente com Drp1 in vitro. No entanto, estudos genéticos demonstraram claramente que Mff é essencial para o êxito da fissão ^7,8 mitocondrial. O método descrito neste manuscrito foi capaz de superar as deficiências anteriores, introduzindo interações lipídicas simultâneas que promovem interações Drp1-QFP. No geral, este romance REVEA ensaiolevou interações fundamentais que orientam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e forneceu uma nova etapa para estudos estruturais e funcionais em curso desta máquina molecular essencial.

Até à data, a análise de interacções entre Drp1 e Mff ter sido complicada pela flexibilidade inerente do Mff ^9, a heterogeneidade dos polímeros Drp1 ^2,10, e a dificuldade de purificação e a reconstituição de comprimento completo Mff com um domínio transmembranar de ¹¹ intacta. Nós abordado esses desafios usando lipossomas NTA (Ni ²⁺⁾ de andaime para reconstituir marcada com His Mff faltando seu domínio transmembranar (MffΔTM-His _6). Esta estratégia foi vantajoso porque MffΔTM foi extremamente solúvel quando sobre-expresso em E. coli, e esta proteína foi isolado facilmente reconstituída em lipossomas de andaime. Quando preso a estes modelos de lípidos, Mff assumido um, voltados para o exterior orientação idêntica na superfície da membrana.Além destas vantagens, lípidos mitocondriais, tais como a cardiolipina, foram adicionados para estabilizar Mff dobragem e de associação com a membrana ^11. A cardiolipina também interage com o domínio variável de ^2,12 Drp1 que podem estabilizar esta região desordenada e facilitar a montagem da máquina de fissão.

Este método robusto é amplamente aplicável para futuros estudos que visam avaliar as interações proteína de membrana-proximal. Através do uso de interacções amarrar / afinidade adicionais, a sofisticação destes estudos de reconstituição da membrana pode ser aumentada para imitar complexidade adicional encontrado na superfície das membranas dentro das células. Ao mesmo tempo, as composições de lípidos podem ser modificados para mimetizar mais precisamente os ambientes nativas destes complexos macromoleculares. Em resumo, este método proporciona um meio para examinar as contribuições relativas de proteínas e lípidos em moldar a morfologias de membrana durante Proc celulares críticascessos.