El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em> In Vitro</em> Sistema
Summary
Este protocolo describe las técnicas para la cuantificación y caracterización de aberraciones cromosómicas in vitro en macrófagos de ratón RAW264.7 después del tratamiento con la materia en partículas del aire ambiente.
Abstract
La exposición a la materia particulada (PM) es un problema de salud mundial importante, lo que puede dañar varios componentes celulares, incluyendo el material genético nuclear. Para evaluar el impacto de la PM en la integridad genética nuclear, aberraciones cromosómicas estructurales se anotaron en los diferenciales de metafase de células de macrófagos de ratón RAW264.7. PM se recoge del aire ambiente, con un muestreador de partículas suspendidas totales alto volumen. El material recogido se solubiliza y se filtra para retener la porción fina soluble en agua. Las partículas se caracterizan por la composición química por resonancia magnética nuclear (RMN). Diferentes concentraciones de suspensión de partículas se añaden a un cultivo in vitro de macrófagos de ratón RAW264.7 durante un tiempo total de exposición de 72 horas, junto con las células de control no tratadas. Al final de la exposición, la cultura es tratada con colcemid para detener las células en metafase. Las células son luego recolectadas, tratados con solución hipotónica, fijado en acetomethanol, dropped en portaobjetos de vidrio y finalmente se tiñeron con solución de Giemsa. Los portaobjetos se examinaron para evaluar las aberraciones cromosómicas estructurales (AC) en metafase se propaga por el aumento de 1.000X utilizando un microscopio de campo brillante. 50-100 propagación de metafase se anotó para cada grupo de tratamiento. Esta técnica es adecuada para la detección de aberraciones estructurales cromosómicas (AC), como roturas de tipo cromátida, intercambios de tipo cromátida, fragmentos acéntricos, cromosomas dicéntricos y anillo, dobles minutos, endorreduplicación y translocaciones de Robertson in vitro después de la exposición a PM. Es un poderoso método para asociar un punto final citogenética bien establecida para las alteraciones epigenéticas.
Introduction
Se ha estimado que la exposición a la materia particulada (PM) hace más de 3 millones de muertes al año en exceso, principalmente por enfermedades cardiopulmonares y cáncer de pulmón 1. De hecho, PM fue reconocido como carcinógeno para los seres humanos por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (Grupo 1), como un mayor riesgo de cáncer de pulmón con el aumento de los niveles de exposición a PM se ha demostrado 2. Curiosamente, casi todas las células cancerosas albergan anomalías cromosómicas numéricas y / o estructurales. carbono orgánico particulado es una variante, compleja y mezcla heterogénea, cuya composición y distribución del tamaño depende de las emisiones, así como las transformaciones físicas y químicas. Es cuentas desde 35-55% de la masa urbana PM 2.5 (PM 2,5 micras de tamaño y más pequeño) y más del 60% del medio rural y continental PM 2.5 masa 3, 4. representa la fracción soluble en agua de un 30-90% de los aerosoles orgánicos. Un gran número de compuestos orgánicoshan sido identificados, incluyendo hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, y sus derivados oxigenados y nitrados, aldehídos alifáticos y alcoholes, ácidos grasos libres y sus sales, ácidos di-carboxílicos, compuestos multifuncionales, proteínas y macromoléculas húmicas-como (Hulis) usando métodos cromatográficos acoplados con técnicas de espectrometría de masas 5-8. Estos compuestos representan menos del 10-20% de carbono orgánico particulado, por tanto, la mayor parte de carbono orgánico es desconocida 9.
La evidencia experimental sugiere que la citotoxicidad, el estrés oxidativo y la inflamación están implicados en el desarrollo de estados patológicos asociados-PM. Se ha demostrado recientemente, sin embargo, que la exposición a PM también se traduce en una serie de alteraciones epigenéticas, incluyendo alteraciones en la metilación del ADN de elementos repetitivos, en tanto experimental en sistemas in vitro y en sujetos humanos 10-12. De particular interés son los efectos dePM del ADN satélite – mayor y menor – satélites que se encuentran en la región de heterocromatina alrededor del centrómero de los cromosomas. Se ha demostrado que estos efectos pueden ser persistentes por naturaleza, ya que se pueden detectar durante al menos 72 horas después de la exposición 12. Las alteraciones en la metilación del ADN, particularmente alrededor de los centrómeros, pueden conducir a la acumulación de transcritos de ARNm de ADN satélite, la integridad cromosómica compromiso durante la división celular y, posteriormente, como resultado el desarrollo de una variedad de estados patológicos 13.
Adaptación de enfoque citogenética para el análisis de CA como un punto final de alteraciones epigenéticas causadas por PM, por lo tanto, es de gran importancia. Aquí, se presenta el enfoque para la recogida y preparación ambiente PM, la exposición in vitro y el análisis de AC a partir del sistema de macrófagos RAW264.7 modelo murino. Los macrófagos constituyen la primera línea de defensa contra los objetos extraños inhalados y, por lo tanto, tla línea celular sirve como un sistema establecido y el modelo más utilizado en toxicología de partículas 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudio citogenético o análisis microscópico de los números o las estructuras de los cromosomas, principalmente en metafase para untar, proporciona información crucial para el pronóstico, la evaluación de riesgos, y el tratamiento de diversas enfermedades. Ahora está bien establecido que anomalías citogenéticas están vinculados con la progresión y el desarrollo de varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Hasta la fecha, CAs se han encontrado en todos los tipos de tumores importantes. AC puede surgir de fo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado, en parte, por el Instituto Nacional del Centro de Salud de Investigaciones Biológicas Excelencia [el número de concesión 1P20GM109005], el Space Grant Arkansas Consorcio a través de Nacional de Aeronáutica y del Espacio [número de concesión NNX15AK32A], y el Instituto Nacional para la Seguridad Ocupacional y salud (NIOSH) [número de concesión 2T420H008436]. Los autores desean agradecer a Christopher Fettes para la corrección y edición de este manuscrito.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
Referenzen
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