Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em> In Vitro</em> System
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.
Abstract
Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM) ist eine der weltweit wichtigsten gesundheitlichen Bedenken, die verschiedene zelluläre Komponenten beschädigen können, einschließlich der nuklearen genetischen Materials. Um die Auswirkungen der PM auf nukleare genetische Integrität, strukturelle Chromosomenaberrationen erzielte in den Metaphasespreitungen der Maus RAW264.7-Makrophagenzellen zu bewerten. PM wird aus der Umgebungsluft mit einem hohen Volumen Schwebstoffe insgesamt Sampler gesammelt. Das gesammelte Material wird solubilisiert und filtriert, um das wasserlösliche, Feinanteil beibehalten. Die Teilchen werden für die chemische Zusammensetzung, die durch Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie charakterisiert. Verschiedene Konzentrationen von Partikelsuspension werden auf eine in – vitro – Kultur von RAW264.7 Makrophagen der Maus für eine Gesamtbelichtungszeit von 72 Stunden zugegeben, zusammen mit unbehandelten Kontrollzellen. Am Ende der Belichtung wird die Kultur mit Colcemid behandelten Zellen in der Metaphase zu verhaften. Die Zellen werden dann geerntet, mit hypotonischer Lösung behandelt, in acetomethanol fixiert, dropped auf Glasobjektträger und schließlich mit Giemsa-Lösung gefärbt. Die Objektträger werden untersucht die strukturellen Chromosomenaberrationen zu bewerten (CAs) in Metaphase bei 1,000x Vergrößerung breitet sich ein Hellfeld-Mikroskop. 50 bis 100 Metaphasespreitung sind für jede Behandlungsgruppe erzielt. Diese Technik ist für den Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen (CAs) wie Chromatidentyp Art bricht, Chromatidentyp Art Austausch, acentric Fragmente angepasst, dizentrischen und Ringchromosomen, Doppel Minuten, Endoreduplikation und Robertson'sche Translokation in vitro nach der Exposition gegen Uhr. Es ist eine leistungsfähige Methode, um eine gut etablierte zytogenetische Endpunkt zu epigenetischen Veränderungen zu verknüpfen.
Introduction
Es wurde geschätzt , dass die Exposition gegenüber Partikeln (PM) verursacht mehr als 3 Millionen zusätzliche Todesfälle jährlich, in erster Linie von Herz – Lungen – Erkrankungen und Lungenkrebs 1. Tatsächlich PM wurde als krebserzeugend für den Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (Gruppe 1), ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs erkannt mit Exposition gegenüber PM zugenommen hat 2 gezeigt. Interessanterweise fast alle Krebszellen beherbergen numerische und / oder strukturelle Chromosomenanomalien. Partikulärer organischer Kohlenstoff ist eine Variante, komplexe und heterogene Mischung, deren Zusammensetzung und Größenverteilung auf die Emissionen abhängig sowie physikalischen und chemischen Umwandlungen. Auf sie entfallen 35 bis 55% der städtischen PM 2.5 Masse (PM 2,5 um Größe und kleiner) und mehr als 60% der ländlichen und kontinentalen Hintergrund PM 2.5 Masse 3, 4. Die wasserlösliche Fraktion einen Anteil von 30-90% der organischen Aerosol. Eine große Anzahl von organischen Verbindungen,identifiziert wurden, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren oxygenierte und nitrierte Derivate, aliphatische Aldehyde und Alkohole, freie Fettsäuren und deren Salze, Di-Carbonsäuren, multifunktionelle Verbindungen, Proteine und Huminsäure artigen Makromoleküle (HULIS) unter Verwendung von chromatographische Methoden gekoppelt mit massenspektrometrischen Techniken 5-8. Diese Verbindungen weisen weniger als 10-20% der partikulären organischen Kohlenstoff, wodurch die meisten organischen Kohlenstoff ist unbekannt 9.
Experimentelle Beweise legen nahe, dass die Zytotoxizität, oxidativer Stress, Entzündung und bei der Entwicklung von PM-assoziierten Krankheitszuständen beteiligt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, jedoch, dass Exposition gegenüber PM resultiert auch in einer Reihe von epigenetischen Veränderungen, einschließlich Änderungen in der DNA – Methylierung von repetitiven Elementen in beiden experimentellen in vitro – Systemen und in menschlichen Subjekten 10-12. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen derPM auf Satelliten-DNA – größere und kleinere Satelliten -, die in der heterochromatischen Region um die Zentromer der Chromosomen zu finden sind. Es wurde gezeigt , daß diese Wirkungen von der Natur persistent sein kann, wie sie für mindestens 72 Stunden nach der Exposition 12 detektiert werden. Veränderungen in der DNA – Methylierung, besonders um Zentromeren kann zur Ansammlung von Satelliten – DNA – mRNA – Transkripte, Kompromisses chromosomale Integrität während der Zellteilung führen und in der Folge in der Entwicklung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen 13 führen.
Die Anpassung der zytogenetischen Ansatz für die Analyse von CAs als Endpunkt epigenetischen Veränderungen von PM verursacht, so ist von großer Bedeutung. Hier berichten wir den Ansatz für die Umgebungs PM Sammlung und Vorbereitung, in vitro – Exposition und Analyse von CAs die murine Makrophagen RAW264.7 Modellsystem. Makrophagen umfassen die erste Verteidigungslinie gegen die inhalierte Fremdkörper und damit tseine Zelllinie dient als etablierter und der am häufigsten verwendete Modell in der Partikel Toxikologie 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zytogenetische Untersuchung oder mikroskopische Analyse der Zahlen oder Strukturen der Chromosomen, in erster Linie in der Metaphase-Spreads, liefert Informationen von entscheidender Bedeutung für die Prognose, die Risikobewertung und die Behandlung für verschiedene Krankheiten. Es ist nun gut etabliert, dass zytogenetische Anomalien, die mit dem Fortschreiten und die Entwicklung von verschiedenen Krankheiten verbunden sind, einschließlich Krebs. Bisher CAs wurden in allen wichtigen Tumorarten gefunden. CAs könn…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde zum Teil durch das National Institute of Health Center of Biological Research Exzellenz [Grant-Nummer 1P20GM109005], der Arkansas Raum Grants Consortium durch National Aeronautics and Space Administration [Gewährungsnummer NNX15AK32A] und das Nationale Institut für Arbeitsschutz und Health (NIOSH) [Gewährungsnummer 2T420H008436]. Die Autoren möchten sich Christopher Fettes für das Korrekturlesen und Bearbeitung des Manuskripts danken.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
Referenzen
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
