マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

動物実験はすべてラートボウト大学医療センター、オランダ、（：77073 RU-DEC-2011から021、プロトコル番号）、動物管理委員会の承認を受け、動物の管理と使用ガイドラインに従って実施しました。 1.グリア細胞の単離および培養 注：ここで紹介するプロトコルは、マッカーシーとデVellis 19の作業に基づいて、マウスのアストロサイトのために非常に類似した詳細なプロトコールは20利用可能です。胚（E18）ラットの脳から皮質星状細胞の初代培養物を生成するために、妊娠中のラットを屠殺する必要があり、胚を子宮から採取する必要があり、脳の胚から単離する必要があります。 T75フラスコを埋めるために、2胚の脳からの皮質を結合する必要があります。代替として、市販の精製及び凍結アストロサイトは、購入することができます。 T75培養フラスコを準備 希釈ポリ-D-リジン（PDL）で10μg/ mLの最終濃度に滅菌超純水。 T75培養フラスコに希釈したPDLの5ミリリットルを追加します。全体の成長表面を濡らすことの周りに優しく振ります。 3時間加湿37℃インキュベーターにフラスコを置きます。 フラスコからPDLを吸引。結合していないPDLを削除するには、5 mLの滅菌水でフラスコ3回すすいでください。完全に水を吸引。層流フードまたは直ちに使用中で乾燥さフラスコを残します。 皮質の解剖 2％（v / v）のB-27サプリメントとLebovitzのL-15培地：50mLの解剖媒体を準備します。氷の上に保管してください。 （ – 8分〜5）呼吸が止まるまで誘導室（小プレキシグラスボックス）にイソフルランで深くラットを麻酔。誘導チャンバーからラットを外し、すぐに頸椎脱臼により安楽死させました。 70％EtOHでラットの腹部をスプレーし、過剰分を拭き取ります。帝王切開secti経由ダムから子宮を露出し、削除はさみ21のペアを使用して上。 、はさみで自分の羊膜嚢から個々の胚をカット冷たい解剖媒体で満たされた無菌のペトリ皿に移し、氷上に保ちます。 冷たい解剖媒体で満たされた新しい、滅菌6センチメートルシャーレに再び胚を移します。実体顕微鏡下で胚からの脳を抽出します。脳を公開するには、静かに鉗子を使用して皮膚や頭蓋骨を引き剥がします。静かに脳全体をかき出す、新鮮な、冷たい解剖培地で35ミリメートルのペトリ皿に移します。 注：胚から切開全脳は、細胞の生存能力を失うことなく、多くの時間、氷上で解剖媒体に格納することができます。 先の細い春のハサミやメスで正中線を切断することにより、各脳の2つの半球を分離します。慎重にまっすぐ先の細いピンセットで髄膜を取り除きます。 注：それは完全に髄膜を除去することが非常に重要です。目アストロサイトの文化の防止線維芽細胞の汚染があります。線維芽細胞は急速に分裂する細胞であり、最終的には他のセルを置換します。 中脳/線条体と春のハサミやメスで嗅球を削除します。また、春のハサミやメスで海馬（perimedianと皮質に対して尾側であるC字型構造）を取り外してください。 5 mLの解剖媒体で満たされた15 mL遠心管中の皮質半球を収集します。氷の上に保管してください。 皮質の解離 準備を2mLのCa 2+ / Mgの2+を含まない0.25％トリプシンでハンクス液（HBSS）（解離培地）。 15％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン（培地）およびフィルター滅菌して50 mLの高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。 組織を遠心分離管の底に沈殿してみましょう。慎重として組織上からできるだけ解剖媒体の限り海賊。 2+ / Mgの2+を含まないHBSS（トリプシンなし）を5mLのCaで組織を洗浄し、組織がチューブの底に沈降することを可能にします。 慎重にHBSSを吸引。 2 mLの分離培地を追加し、組織の周りに酵素を混合するために穏やかにチューブをフリック。 5〜10分間37℃の水浴中でインキュベートします。組織を攪拌するインキュベーションの間、チューブを数回フリック。 すぐに千μLピペットチップを用いて組織を粉砕します。約800μLのピペッターの音量を設定します。片を吸引し、直接流体ラインの上に、チューブの側に強制的に排出します。しかし、気泡や発泡を最小限に抑えるようにしてください。 20倍 – 組織が約15、十分に解離されるまで繰り返します。トリプシンを不活性化するために8 mLの培地を追加します。静かにチューブを数回転倒混和します。 50 mの位置上に配置された70μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を渡しますLの遠心分離管。培地で15 mLのチューブを洗浄し、細胞懸濁液を50 mLチューブに培地を収集するために、セルストレーナーを通して媒体を濾過します。培地で細胞ストレーナーを数回すすいでください。 25 mLの – 洗浄した後、最終体積は約20であるべきです。 10分間、200×gで細胞をペレット化。慎重に細胞ペレットを触れることなく、できるだけ多くの媒体を吸引します。 1000μLのピペットを用いて1mLの培地中で細胞を再懸濁。 11 mLの予め温めた培地を追加し、10 mLのピペットを用いて（気泡を防止するために）穏やかに混合します。 5 mLの培養培地で1回PDLでコーティングされたT75フラスコをすすぎます。培地を吸引し、フラスコに細胞懸濁液を転送します。すべての細胞をプレーティングされる懸濁液中であり、我々は、アストロサイトは、懸濁液中の他の細胞から分化することができないので、それは一般的に不必要な、それらをカウントする見つけます。 5％CO 2のfの雰囲気で加湿した37℃のインキュベーターにフラスコを置きますまたは2日間。 アストロサイトの拡張とメンテナンス 最初のプレーティング後、初めて2日間、媒体全体を交換してください。 3日毎に、その後、媒体全体を交換してください。常に細胞に添加する前に37°Cに新鮮な培地をprewarm。 注： – （アストロサイトは、ミクログリアとオリゴデンドロサイトは、トップと混在上に横たわると、高密度に充填されたテッセレーションされた単層として表示されます）約90％の密集度に到達するために10日間のアストロサイトは、7が必要です。 アストロサイトは、約90％の密集度に到達すると、夾雑グリア細胞を除去するために、フラスコを振ります。 インキュベーターからフラスコを外し、キャップを締めてください（フェノール）または（フィルタリング）ポートをカバーしています。ミクログリアを削除するには、1時間、180 rpmでオービタルプラットフォーム上でフラスコを振ります。培地を吸引除去します。 5 mLの予め温めた培地で一回すすぎ、吸引および12 mLの培地と交換してください。 削除するオリゴデンドロサイトは、軌道プラットフォームにフラスコを返し、7時間の最低250rpmで、37℃で振るが、好ましくはO / N。 培地を吸引除去します。 5 mLの予め温めた培地で一回すすぎ、吸引および12 mLの培地と交換してください。インキュベーターにフラスコを返します。 0.05％トリプシン – エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で2：1〜3：100％コンフルエントで、1の割合で標準的な手順を使用して星状細胞を分割します。 100％の集密度でT75フラスコは、典型的には、合計で約4.0×10 6個の細胞が得られます。このスケジュールの下では、培養は通常、週1回分割することができます。 注：星状細胞は、コンフルエントに達したとき、プロトコルステップ3.4において以下に記載されるように、それらを採取し、hiPSCの分化のために使用することができます。星状細胞は生存能力の顕著な損失なしに少なくとも一度分割することができます。彼らは、培養中の最大2ヶ月間維持することができます。経験から、一次胎生18日のラットアストロサイトのPROGRessively最終分化になり、および/または反復分割後の生存率を失います。それは将来の使用のためにアストロサイトを凍結することは可能ですが、我々は必要なときに新鮮胚脳からアストロサイトを単離することを好みます。 rtTAの2世代/ Ngn2陽性hiPSCs 注：再プログラミングがcMYCは、SOX2、OCT4およびKLF4因子で私たちの実験のために使用hiPSCsは、ヒト線維芽細胞のレンチウイルス形質導入により、社内で作成しました。 注：rtTA の / Ngn2陽性hiPSCsの世代のために、レンチウイルスベクターを安定hiPSCsのゲノム中に導入遺伝子を組み込むために使用されています。レンチウイルスの産生のためのプロトコルは、22以前に公開されています。 rtTAとNgn2レンチウイルス粒子を生成するために使用されるレンチウイルスパッケージングベクターの詳細が設けられています<strong>材料/機器の表。 rtTAのレンチウイルスのために使用されるトランスファーベクターはpLVX-EF1α-です（テト・オン・アドバンス）-IRES-G418（R）; すなわち、このベクターは、構成EF1αプロモーターの制御下でのTet-Onの高度トランスをコードし、抗生物質G418に対する耐性を付与します。 Ngn2レンチウイルスのために使用される転移ベクターは、あるpLVX-（TRE-thight） – （MOUSE）Ngn2-PGK-ピューロマイシン（R）; すなわち 、このベクターは、構成的PGKプロモーターの制御下でのTet制御プロモーターおよびピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にマウスニューロゲニン-2の遺伝子をコードしています。したがって、これらの2つの転送ベクトルを用いて、hiPSCラインを作成することができるが、そのために、マウスニューロゲニン-2の発現は、ドキシサイクリンを含む培地を補充することによって誘導することができます。 hiPSCsの形質導入のために、レンチウイルス粒子と上澄み液が使用されている、すなわち 、ウィット（テキストの残りの部分に「レンチウイルスサスペンション」と呼ばれます）超遠心分離を使用して粒子を集中ハウト。 hiPSCsをプレート（1日目） 注：このプロトコルに記載されているボリュームがhiPSCsは、6ウェルプレート中で培養すること、および1つのウェルの細胞を回収していることを前提としています。また、細胞は、12ウェルプレートの12ウェルに続いてメッキされているものとします。 希釈されたBMMを得るために、1％（v / v）の基底膜マトリックス（BMM）と10 mLの冷たいDMEM / F12を準備します。 12ウェルプレートのウェルあたりBMM希釈し、800μLを追加します。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で少なくとも1時間インキュベートします。使用する前に、室温で1時間静置します。 1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン、9 mLのDMEM / F12と室温に1 mLの細胞剥離液（CDS）とウォーム15 mLのエッセンシャル8（E8）培地。 Rho関連タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤とE8媒体を補います。 hiPSCsの使用済み培地を吸引D hiPSCsに1 mLのCDSを追加します。 5％のCO 2の雰囲気で加湿37℃インキュベーター中で5分間- 3インキュベートします。細胞が互いに着脱されているかどうかを顕微鏡下で確認してください。 優しく千μLピペットで細胞を懸濁し、15 mLのチューブに細胞を移す、十分に2mLのDMEM / F12を追加します。細胞懸濁液に7 mLのDMEM / F12を追加します。 5分間、200×gで細胞をスピン。 上清を吸引し、準備E8培地2mlを追加します。 15 mLチューブの側面に千μLピペットの先端を入れ、軽く細胞を再懸濁することにより、（細胞塊を形成しない）hiPSCsが解離された細胞懸濁液を得ます。細胞が解離されているかどうかを顕微鏡下で確認してください。 血球計数器チャンバーを用いて細胞（細胞/ mL）の数を決定します。 注：80で6ウェルプレート-合計で4.0×10 6細胞- 90％の密集度は、典型的には3.0が得られます。 吸引物12ウェルプレートのウェルからのBMMに希釈しました。 3.0×10 4細胞/ mLの細胞懸濁液を得るために細胞を希釈します。プレート12ウェルプレートのウェル当たり細胞懸濁液1ml。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で12ウェルプレートO / Nを配置します。 rtTAのとNgn2レンチウイルスを持つiPS細胞を形質導入（2日目） 室温に1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンとウォーム12 mLのE8媒体。 E8媒体8 / mlの最終濃度にROCK阻害剤とポリブレンとE8培地を補います。 レンチウイルス懸濁液でアリコートを解凍します。レンチウイルス懸濁液に8μgの/ mLの最終濃度にポリブレンを追加します。使用済み培地を吸引除去し、各ウェルに用意E8培地1mlを追加します。 Ngn2 -lentivirus懸濁液-異なるrtTAの量と伝達を行います。例えば、transdu12ウェルプレートの1ウェルにrtTAの -lentivirusとNgn2 -lentivirusサスペンションの両方の100μLを添加することにより、CE hiPSCsを。他のウェルは、レンチウイルス懸濁液の代わりに100μLを200μL、300μL、400μLおよび500μLを使用します。 12ウェルプレートの2つのウェルのhiPSCsは、形質導入すべきではありません。彼らは選択の間のコントロールとして機能します。 注：形質導入効率は、選択の開始後に、より正確に推定することができるように、形質導入は、好ましくは、（プロトコルステップ2.2.4を参照）、重複して行われます。効率的hiPSCsの大半を形質導入するために必要とされるレンチウイルス懸濁液の量は、レンチウイルス懸濁液の力価および使用されているhiPSCラインに依存します。 hiPSCsを形質導入するためにレンチウイルス懸濁液を500μL – 本研究では、通常は100を使用しています。 5％COの雰囲気で加湿37℃インキュベーター中で12ウェルプレートを置き6時間2。 6時間のインキュベーション期間の終了前に、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン及び12とウォーム12 mLのE8媒体RTへmLのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）。 ROCK阻害剤とE8媒体を補います。 費やしE8媒体を吸引。 1 mLのDPBSで各ウェルを洗浄します。各ウェルに用意E8媒体の1 mLを加え。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で12ウェルプレートO / Nを配置します。 E8媒体をリフレッシュ（3日目） RTに1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンとウォーム12 mLのE8媒体。 12ウェルプレートのウェルから使用済み培地を吸引除去し、各ウェルに準備E8培地1mlを追加します。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で12ウェルプレートO / Nを配置します。 ピューロマイシンおよびG418で選択を行う（日4から8） 注：ヒップの細胞分裂速度に依存培養物を分割する必要がある点で、選択期間中に80％のコンフルエンシー – SCラインおよびレンチウイルス形質導入の効率は、細胞が70に到達することができます。分割のタイミングを事前に予測することはできないので、プロトコルに記載されません。しかし、代わりにピューロマイシンおよびG418の言及濃度を補っE8媒体をリフレッシュするの、1は（ビトロネクチンでコーティングされたプレート上に細胞をプレーティングを含む）は、通常のhiPSC文化としてhiPSC文化を分割することができます。唯一の例外は、E8媒体が選択を継続する抗生物質の言及濃度を補充する必要があることです。 室温に1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンとウォーム12 mLのE8媒体。選択のためのピューロマイシンおよびG418を追加します。抗生物質の異なる量は、選択期間（ 表1）中に添加されます。 G418-およびピューロマイシンの割合を推定することにより、形質導入の効率を推定耐性細胞。耐性細胞の割合を推定するために、異なる条件（レンチウイルス懸濁液の異なる量で形質導入培養）のために死んだ細胞の割合（非耐性細胞）を推定し、nontransduced細胞（選択制御としての役割を果たす細胞）のために。 [ – （死細胞の割合）100％]として耐性細胞の割合を計算します。 注：レンチウイルス懸濁液の異なる量の形質導入は、二重に行われた場合、形質導入効率をより正確に推定することができます。非形質導入細胞を用いた条件は、選択コントロールとして機能します。レンチウイルス懸濁液の異なる量で形質導入培養のための死細胞の割合は低くあるべきです。耐性細胞の推定割合は、おそらく両方の導入遺伝子について陽性であるhiPSCsを選択するために使用されます。一般的に、我々は、伝達状態からhiPSCsは、細胞の> 90％であった選択しますsが5日間の選択期間を生き残ります。 hiPSCsの使用済み培地を吸引し、ウェルに準備E8培地1mlを追加します。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で12ウェルプレートO / Nを配置します。 G418の最終濃度 ピューロマイシンの最終濃度 4日目 250 / mlの 2 / mlの 5日目 250 / mlの 2 / mlの 6日目 250 / mlの 1μg/ mLの 7日目 250 / mlの 1μg/ mLの 8日目 250 / mlの 1μg/ mLの 表1：選択期間に抗生物質の濃度。 </stチョロン>選択期間の5日間、ピューロマイシンおよびG418の濃度。 選択を停止し、定期的に培養を開始（9日目以降） 5日間の選択期間後に、培養物のrtTA / Ngn2陽性hiPSCs通常hiPSCsとして、細胞のE8培地を50μg/ mlの最終濃度にし、最終濃度をピューロマイシンでG418を補充していることを除いて0.5μgの/ mLです。 注：細胞は今バックアップとして機能する（細胞の凍結保存のための標準的なプロトコルに従って）凍結することができます。それは多くの将来の分化実験のためのrtTA / Ngn2陽性hiPSCsの同じバッチを使用することができるので、これは、分化プロトコルの再現のための重要なステップです。 6ウェル上のニューロンへのrtTA / Ngn2陽性hiPSCsの3分化多国間環境協定とガラスカバースリップ 注：このプロトコルでは、詳細が2つの基板、 すなわち 6ウェルのMEAとガラスカバースリップで（ウェル当たり9記録1参照組み込みマイクロ電極で6つの独立したウェルで構成されるデバイス）上のrtTA / Ngn2陽性hiPSCsを区別するために設けられています24ウェルプレートのウェル。プロトコルは、しかしながら、容易に表面積に応じて述べた値をスケーリングすることにより、（12-または6-ウェルプレートのウェルについて、 例えば ）より大きな基板に適合させることができます。 MEAまたはカバーガラス（0日と1日目）を準備 分化の開始の前日には、製造業者の推奨に従ってのMEAを殺菌します。 接着タンパク質ポリ-L-オルニチン（PLO）滅菌超純水で最終濃度を50μg/ mLに希釈します。コート100μLを配置することにより、6ウェルのMEAの活性電極面積各ウェルの希釈されたPLOのドロップ。滅菌ピンセットを用いて、24ウェルプレートのウェルにカバースリップを置きます。各ウェルに希釈されたPLOの800μLを追加します。 1000年μLピペットチップでそれらを押し下げて、フローティングからカバースリップを防ぎます。 5％CO 2の雰囲気下で6ウェルのMEA、24ウェルプレートのO / Nで加湿した37℃のインキュベーターに培養します。次の日は、希釈されたPLOを吸引します。滅菌超純水で2回、6ウェルのMEAのガラス面とカバースリップを洗ってください。 （6ウェルMEAについて）を20μg/ mLおよび（カバーガラス用）を10μg/ mLの最終濃度になるように冷たいDMEM / F12中でラミニンを希釈します。各ウェル中の100μLの滴を配置することによって、すぐにコート6ウェルのMEAの活性電極面積を。同様に、コートに24ウェルプレートの各ウェルに希釈したラミニンのカバースリップを400μLを追加します。千μLピペットチップでそれらを押し下げて、フローティングからカバースリップを防ぎます。 少なくとも2時間、5％の大気CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中で6ウェルのMEA、24ウェルプレートをインキュベート。 hiPSCsをプレート（1日目） 注：ステップ3.2.1に記載されているボリューム- 3.2.4 のrtTA / Ngn2陽性hiPSCsは、6ウェルプレート中で培養すること、および1つのウェルの細胞を回収していることを前提としています。 6ウェルのMEAおよび/またはカバーガラス上の細胞をプレーティングするために必要とされるボリュームは、6ウェルのMEAの数及び/又は実験に使用されているカバースリップの数に依存します。ステップ3.2.6で指定された番号 – 3.2.8は、異なる実験のサイズにスケーリングすることができます。 暖かいDMEM / F12、CDSおよびR / T、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンでE8媒体。 E8媒体への最終的な4μgの/ mLの濃度とROCK阻害剤にドキシサイクリンを追加します。 rtTA / Ngn2陽性hiPSCsの使用済み培地を吸引し、1メートルを追加hiPSCsにLのCDS。 5％のCO 2の雰囲気で加湿37℃インキュベーター中で5分間- 3インキュベートします。細胞が互いに着脱されているかどうかを顕微鏡下で確認してください。 優しく千μLピペットで細胞を懸濁し、15 mLのチューブに細胞を移す、十分に2mLのDMEM / F12を追加します。細胞懸濁液に7 mLのDMEM / F12を追加します。 5分間、200×gで細胞をスピン。 上清を吸引し、準備E8培地2mlを追加します。 15 mLチューブの側面に千μLピペットの先端を入れ、軽く細胞を再懸濁することによりhiPSCsを解離。細胞が解離されているかどうかを顕微鏡下で確認してください。 血球計数器チャンバーを用いて細胞（細胞/ mL）の数を決定します。 注：80で6ウェルプレート-合計で4.0×10 6細胞- 90％の密集度は、典型的には3.0が得られます。 希釈されたラミニンを吸引。 6ウェルのMEAについては、CEを得るために細胞を希釈7.5×10 5細胞/ mLのLLサスペンション。 6ウェルのMEAの各ウェル内の活性電極領域に細胞懸濁液100μLの液滴を加えることにより細胞をプレート。カバーガラスは、4.0×10 4細胞/ mLの細胞懸濁液を得るために細胞を希釈します。 24ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液500μLを添加して細胞をプレート。 注：MEAの上の最終細胞密度は、カバーガラス（ 図1AおよびB）よりも高いです。我々は、この高い細胞密度は、ネットワーク活動の適切な記録のために必要であったことを見出しました。プロトコルでは、数字は、アッセイに最適であることが判明したが提供されます。 2時間（MEAの）またはO / N（24ウェルプレート）、5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中で6ウェルのMEAおよび24ウェルプレートを置きます。 2時間後、慎重に6ウェルのMEAの各ウェルに用意E8媒体の500μLを追加します。 6 – 私たちを置きますLLのMEA O / N 5％CO 2の雰囲気で加湿37℃インキュベーターインチ 培地を変更します（2日目） 翌日、1％（v / v）のN-2サプリメント、1％（v / v）の非必須アミノ酸、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM / F12を準備します。最終10ng / mLの濃度、および4μgの最終濃度をドキシサイクリンに10ng / mLの最終濃度のヒト組換えニューロトロフィン-3（NT-3）、ヒト組換え脳由来神経栄養因子（BDNF）を追加/ mLです。 37℃に培地を温めます。 培地に0.2μgの/ mLの最終濃度にラミニンを追加します。得られた培地をフィルタリングします。 6ウェルのMEAのウェルから使用済み培地および24ウェルプレートを吸引し、準備された培地に交換してください。 5％CO 2の雰囲気下で6ウェルのMEA、24ウェルプレートのO / Nで加湿した37℃のインキュベーターに培養します。 ラットアストロサイトを追加します（3日目） <br/> 注：このプロトコルに記載されているボリュームがラットアストロサイトは、T75培養フラスコ中で培養することを前提としています。培養物に添加されたラットアストロサイトは、良い品質のものであることが重要です。我々は、ラットアストロサイトは、良い品質のものであるかどうかをチェックするために2つの基準を使用します。まず、ラットアストロサイトの文化は、ラット胚の脳からの単離後10日以内にコンフルエントに成長させることができるはずです。第二に、ラットアストロサイトの文化を分割した後、ラットの星状細胞はコンフルエント、テッセレーションの単層（ 図1C）を形成することができるはずです。ラットアストロサイト培養物は、これらの2つの基準を満たさない場合、我々は、分化実験のために、この培養物を使用しないように助言します。 RTへの暖かい0.05％トリプシン-EDTA。 1％DPBSおよびDMEM / F12を温め、37℃まで（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン。 ラットアストロサイト培養液の使用済み培地を吸引除去します。 5 mLのDPBSを追加することにより、文化を洗浄し、周りに軽く振ります。 AspirDPBSを食べ、5 mLの0.05％トリプシン-EDTAを追加します。周りに優しくトリプシンEDTAを振ります。 10分- 5、5％の大気CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中でインキュベートします。 細胞が分離されているかどうかを顕微鏡下で確認してください。フラスコを数回押すことで、最後のセルを切り離します。 フラスコにDMEM / F12の5ミリリットルを追加します。 10 mLのピペットで静かにフラスコ内の細胞を粉砕します。 15 mLチューブ中の細胞懸濁液を収集します。 8分間、200×gでチューブをスピン。 上清を吸引し、DMEM / F12 1 mLに細胞を再懸濁。血球計数器チャンバーを用いて細胞（細胞/ mL）の数を決定します。 6ウェルのMEAのウェルあたり7.5×10 4アストロサイトを追加します。 24ウェルプレートのウェルあたり2.0×10 4アストロサイトを追加します。 5％CO 2の雰囲気で加湿した37℃のインキュベーター中のMEAおよび24ウェルプレートO / Nインキュベートします。 培地を変更します（4日目） <li> 2％（v / v）のB-27サプリメント、1％（v / v）のL-アラニル-L-グルタミンおよび1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを神経基礎培地を準備します。 4μg/ mLの最終濃度に10ng / mLの、及びドキシサイクリンの最終濃度を10ng / mLの、BDNFの最終濃度にNT-3を加えます。また、2μMの濃度にシトシンβ-D-アラビノフラノシドを追加します。 注：シトシンβ-D-アラビノフラノシドは、星状細胞の増殖を阻害し、神経細胞に分化されていない残りのhiPSCsを殺すために培地に添加されます。 37°Cまでの媒体と暖かいをフィルタリングします。 6ウェルのMEAのウェルから使用済み培地および24ウェルプレートを吸引し、準備された培地に交換してください。 5％CO 2の雰囲気で加湿37℃インキュベーターで6ウェルのMEA、24ウェルプレートを維持します。 培地をリフレッシュ（日6から28まで） 注：6日目から開始して、リフレッシュ半分培地の2日ごと。以降10日目からは、培地は、星状細胞の生存性をサポートするために、FBSが補充されます。 2％（v / v）のB-27サプリメント、1％（v / v）のL-アラニル-L-グルタミンおよび1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを神経基礎培地を調製。 4μg/ mLの最終濃度に10ng / mLの、及びドキシサイクリンの最終濃度を10ng / mLの、BDNFの最終濃度にNT-3を加えます。 10日目以降からは、また、2.5％（v / v）のFBSを含む培地を補います。 37°Cに生じた培地と暖かいをフィルタリングします。 1000年μLピペットを用いて、6ウェルのMEA、24ウェルプレートのウェルから使用済み培地の半分を削除し、準備された培地に交換してください。 5％CO 2の雰囲気で加湿37℃インキュベーターで6ウェルのMEA、24ウェルプレートを維持します。 4. hiPSC由来のニューロンの神経生理学的プロフィールを確立 注：で後2〜3週間分化のductionは、hiPSC由来のニューロンは、異なる下流の分析のために使用することができます。このセクションでは、いくつかの下流の分析の例は、hiPSC由来のニューロンの神経生理学的プロフィールを確立するために行うことができる与えられています。 MEAを用いた神経回路網の活動を特徴づけます MEAの上で培養hiPSC由来の神経細胞の電気生理学的活動の記録20分。録音中、37℃の温度を維持し、MEAに加湿ガス（5％CO 2、20％O 2、75％N 2）の定数、遅い流れを膨張させることにより、媒体の蒸発およびpH変化を防ぎます。 1200X増幅（MEA 1060 MCS）後、MCSデータ収集カードを使用して10kHzで信号をサンプリングします。カスタム・ソフトウェア・パッケージ23を使用してデータ（スパイクおよびバースト検出）分析。 単一細胞電気生理学的活性を特徴付けます </stronグラム> 正立顕微鏡に沈め固定段の記録室にhiPSC由来の神経細胞の培養を含むカバースリップを転送します。自発的な活動電位誘発性シナプス後電流（sEPSC）24の記録20分。神経科学プログラムを使用して、シナプス事象を検出します。 ニューロンの形態およびシナプシン表情を特徴付けます 修正して、MAP2のためhiPSC由来の神経細胞を染色、シナプシン1月2日、および22、24、25、PSD-95。画像解析ソフトウェアを用いてシナプシン-1/2、PSD-95涙点の数を定量化します。