Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Alle Versuche an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung des Animal Care Committee, Radboud University Medical Center, Niederlande, (: 77073 RU-DEC-2011-021, Protokollnummer) durchgeführt. 1. Glia Zellisolierung und Kultur HINWEIS: Die hier vorgestellten Protokoll über die Arbeit von McCarthy basiert und de Vellis 19 und ein sehr ähnliches detailliertes Protokoll für Astrozyten Maus zur Verfügung steht 20. Um Primärkulturen von kortikalen Astrozyten aus embryonalen (E18) Rattenhirnen erzeugen, eine schwangere Ratte muss geopfert werden, müssen die Embryonen aus der Gebärmutter, geerntet werden, und die Gehirne müssen aus den Embryonen isoliert werden. Um eine T75-Flasche füllen, müssen die Rinden von 2 embryonalen Gehirn kombiniert werden. Als Alternative können im Handel erhältlich gereinigt und gefrorenen Astrozyten erworben werden. Bereiten Sie die T75 Kulturflasche Verdünnte Poly-D-Lysine (PDL) insterile, Reinstwasser bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / mL. 5 ml der verdünnten PDL an die T75-Kulturkolben. Swish um sanft die gesamte Wachstumsoberfläche zu benetzen. Der Kolben wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für 3 h. Saugen Sie das PDL aus dem Kolben. Spülen Sie die Flasche 3x mit 5 ml sterilem Wasser ungebundenen PDL zu entfernen. Absaugen das Wasser vollständig. Lassen Sie den Kolben eine laminare Strömung Abzug trocknen oder sofort verwendet. Dissection der Rinden Vorbereitung 50 mL dissection medium: Lebovitz des L-15-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement. Halten Sie sich auf dem Eis. Anesthetize die Ratte tief mit Isofluran in einer Induktionskammer (kleine Plexiglas-Box), bis die Atmung aufhört (~ 5 bis 8 min). Entfernen Ratte aus der Induktionskammer und unmittelbar durch Genickbruch getötet. Sprühen Sie den Bauch der Ratte mit 70% EtOH und wischen Sie den Überschuss entfernt. Expose und die Gebärmutter aus dem Damm per Kaiser Abschnit entfernenauf eine Schere 21 verwendet wird . Schneiden Sie einzelne Embryonen aus ihren Fruchtblasen mit einer Schere, übertragen in eine sterile Petrischale mit kaltem Dissektion Medium gefüllt und auf Eis halten. Transfer-Embryonen wieder an eine neue, sterile 6 cm Petrischale mit kaltem Dissektion Medium gefüllt. Extrahieren Sie Gehirne von den Embryonen unter einem Stereomikroskop. Um das Gehirn aussetzen, schälen die Haut sanft und Schädel mit einer Pinzette entfernt. Schaufel vorsichtig das gesamte Gehirn aus und übertragen auf eine 35 mm Petrischale mit frischem, kaltem Dissektion Medium. ANMERKUNG: Vollständige Gehirne von Embryonen seziert ohne Verlust zelluläre Lebensfähigkeit für viele Stunden in Dissektion Medium auf Eis gelagert werden. Trennen Sie die beiden Hemisphären jedes Gehirn, indem sie mit feinen bestückte Feder Schere oder einem Skalpell durch die Mittellinie zu schneiden. abstreifen vorsichtig die Meningen mit geraden feinen bestückte Zange. HINWEIS: Es ist sehr wichtig , die Meningen vollständig zu entfernen. thverhindert ist Fibroblast Kontamination der Astrozyten Kultur. Fibroblasten werden Dividieren schnell teilenden Zellen und wird schließlich die anderen Zellen verdrängen. Entfernen Sie die Mittelhirns / Striatum und den Riechkolben mit Feder Schere oder einem Skalpell. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Hippocampus (C-förmige Struktur, die in Bezug auf die Rinde perimedian und Schwanz ist) zu entfernen mit Feder Schere oder einem Skalpell. Sammeln Sie die kortikale Hemisphären in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt mit 5 ml Dissektion Medium. Halten Sie sich auf dem Eis. Die Dissoziation der Rinden Bereiten 2 mL Ca 2+ / Mg 2+ -freier Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 0,25% Trypsin (Dissoziation Medium). Vorbereitung 50 ml Hoch-glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 15% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin (Kulturmedium) und Filter sterilisieren. Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Zentrifugenröhrchens absetzen. vorsichtig wiePirat so viel von der Dissektion Medium wie möglich von über dem Gewebe. Waschen des Gewebes mit 5 mL Ca 2+ / Mg 2+ -freiem HBSS (ohne Trypsin) und ermöglichen es dem Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen. aspirieren vorsichtig die HBSS. 2 mL Dissoziation Medium und Flick das Rohr sanft um das Enzym zu mischen um das Gewebe. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 5-10 min. Flick das Rohr ein paar Mal während der Inkubation des Gewebes zu bewegen. Unmittelbar verreiben das Gewebe eine 1000 ul Pipettenspitze. Stellen Sie das Pipettiergerät Volumen auf etwa 800 & mgr; l. zwangsweise auf die Seite des Rohres, direkt über die Fluidleitung anzusaugen, die Stücke und auszuwerfen. Allerdings versuchen Blasen oder Schäumen zu minimieren. Wiederholen, bis das Gewebe ausreichend distanzierte, etwa 15 – 20-fach. 8 ml Kulturmedium, um das Trypsin zu inaktivieren. Vorsichtig mischen durch das Rohr mehrmals umgekehrt wird. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb auf einem 50 m platziertL-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das 15 ml-Röhrchen mit Kulturmedium und filtern das Medium durch die Zellsieb das Medium in der 50-ml-Röhrchen mit der Zellsuspension zu sammeln. Spülen Sie die Zelle Sieb ein paar Mal mit Kulturmedium. 25 ml – nach dem Spülen sollte das Endvolumen etwa 20 sein. Pelletieren Sie die Zellen bei 200 · g für 10 min. Sorgfältig absaugen so viel Medium wie möglich, ohne das Zellpellet zu berühren. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Kulturmedium mit einer 1000 & mgr; l-Pipette. In 11 ml vorgewärmtem Kulturmedium und vorsichtig mischen (zu verhindern, dass Blasen) eine 10 ml Pipette. Spülen Sie die PDL-beschichteten T75-Kolben einmal mit 5 ml Kulturmedium. Saugen Sie das Medium und Transfer in den Kolben der Zellsuspension. Alle Zellen in der Suspension werden überzogen, und wir finden es im allgemeinen nicht notwendig, sie zu zählen, da Astrozyten nicht von anderen Zellen in der Suspension zu unterscheiden. Der Kolben wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 foder zwei Tage. Erweiterung und Wartung der Astrozyten Ersetzen Sie das gesamte Medium zum ersten Mal 2 d nach der ersten Beschichtung. Ersetzen Sie das gesamte Medium danach alle 3 d. Immer vorwärmen das frische Medium auf 37 ° C vor der Zugabe zu den Zellen. HINWEIS: Die Astrozyten erfordern 7 bis 10 d etwa 90% Konfluenz zu erreichen (die Astrozyten erscheinen als eine dicht gepackte tessellated einschichtigen, mit Mikroglia und Oligodendrozyten oben liegende und miteinander vermischt). Wenn die Astrozyten etwa 90% Konfluenz erreichen, schütteln Sie die Flasche um die kontaminierenden Gliazellen zu entfernen: Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und ziehen Sie die Kappe (Phenol) oder der Anschlussabdeckung (gefiltert). Um Mikroglia, schütteln Sie die Flasche auf einem Orbitalplattform bei 180 Umdrehungen pro Minute für 1 h zu entfernen. Saugen Sie das Medium. Spülen Sie einmal mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium, absaugen und ersetzen mit 12 ml Kulturmedium. Zu entfernendie Oligodendrozyten, kehren die Kolben auf der Orbitalplattform und Schütteln bei 250 rpm, 37 ° C für mindestens 7 h, aber vorzugsweise O / N. Saugen Sie das Medium. Spülen Sie einmal mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium, absaugen und ersetzen mit 12 ml Kulturmedium. Bringen Sie den Kolben in den Inkubator. Wenn 100% konfluent, spalten die Astrozyten mit Standardverfahren in einem Verhältnis von 1: 3 bis 1: 2 mit 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Ein T75 – Kolben bei 100% Konfluenz typischerweise etwa 4,0 x 10 6 Zellen in insgesamt ergeben. Unter diesem Zeitplan können die Kulturen der Regel pro Woche aufgeteilt einmal werden. HINWEIS: Wenn die Astrozyten Konfluenz erreicht haben , können sie geerntet und für hiPSC Differenzierung verwendet werden , wie unten in Protokoll Schritt 3.4 beschrieben. Die Astrozyten kann ohne nennenswerten Verlust der Lebensfähigkeit mindestens einmal aufgeteilt werden. Sie können für bis zu 2 Monate in Kultur gehalten werden. Aus Erfahrung primären Progr embryonalen Tag 18 Ratte Astrozytenwerden essively terminal differenziert und / oder verlieren Lebensfähigkeit nach wiederholter Spaltung. Obwohl es möglich ist, die Astrozyten für die zukünftige Verwendung einzufrieren, bevorzugen wir die Astrozyten aus frischen embryonalen Gehirn zu isolieren, wenn erforderlich. 2. Erzeugung von rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs HINWEIS: Die hiPSCs für unsere Experimente wurden verwendet , um in-house durch lentivirale Transduktion von humanen Fibroblasten erzeugt mit der Neuprogrammierung cMYC Faktoren SOX2, OCT4 und KLF4. HINWEIS: Für die Erzeugung von rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs werden lentiviralen Vektoren verwendet , um in stabiler Weise die Transgene in das Genom der hiPSCs integrieren. Das Protokoll für die Herstellung der lentivirus wurde zuvor 22 veröffentlicht. Die Einzelheiten der lentiviralen Verpackungsvektoren, die die rtTA und Ngn2 Lentivirus – Partikel verwendet werden , herzustellen , sind in der vorgesehenen <strong> Tabelle der Materialien / Ausrüstung. Der Transfervektor für die rtTA Lentiviren verwendet wird , ist pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dh dieser Vektor codiert ein Tet-On Erweiterte Transaktivator unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors EF1 & agr; und verleiht Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418. Der Transfervektor für die Ngn2 Lentivirus verwendete pLVX- (TRE-thight) – (Maus) Ngn2-PGK-Puromycin (R); dh dieser Vektor codiert das Gen für murine Neurogenin-2 unter der Kontrolle eines Tet-gesteuerten Promotors und des Puromycin – Resistenz – Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors PGK. Somit kann durch diese beiden Transfervektoren verwendet wird, kann eine hiPSC Linie für die geschaffen werden, die die Expression von Maus-neurogenin-2 kann durch Ergänzung des Mediums mit Doxycyclin induziert werden. Für die Transduktion der hiPSCs, der Überstand mit den Lentivirus – Partikel verwendet wird (bezeichnet als "Lentivirus Suspension 'in den Rest des Textes), dh without Konzentration der Partikel Ultrazentrifugation verwendet wird. Platte , die die hiPSCs (Tag 1) HINWEIS: Die Volumina , die in diesem Protokoll genannt werden annehmen , daß die hiPSCs in einer 6 – Well – Platte kultiviert werden , und daß die Zellen von einer gut geerntet. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Zellen anschließend in 12 Vertiefungen einer 12-Well-Platte ausplattiert. Herstellung von 10 ml kaltem DMEM / F12 mit 1% (v / v) Basalmembranmatrix (BMM) verdünnt BMM zu erhalten. In 800 & mgr; l verdünnt BMM pro Vertiefung einer 12-Well-Platte. Mindestens 1 h in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C inkubieren mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Vor der Verwendung Die Platte für 1 h bei RT. Warm 15 ml ätherisches 8 (E8) -Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin, 9 ml DMEM / F12 und 1 ml Zellentfernungslösung (CDS) auf Raumtemperatur. Ergänzen Sie die E8-Medium mit Rho-assoziierten Protein-Kinase (ROCK) -Inhibitor. Saugen Sie das verbrauchte Medium der hiPSCs eind 1 mL CDS auf die hiPSCs. Inkubieren von 3 bis 5 min in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Prüfen unter dem Mikroskop, ob die Zellen voneinander Lösen werden. In 2 ml DMEM / F12 in den Brunnen, zu suspendieren die Zellen vorsichtig mit einem 1000 ul Pipette und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Röhrchen. 7 ml DMEM / F12 zu der Zellsuspension. Dreh die Zellen bei 200 · g für 5 min. Den Überstand aspirieren und 2 mL des E8-Medium hergestellt. Besorgen Sie sich eine Zellsuspension, in der die hiPSCs gelöst sind (bilden keine Zellklumpen) durch die Spitze eines 1000 ul Pipette gegen die Seite des 15-ml-Röhrchen setzen und Resuspendieren der sanft Zellen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelöst sind. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer. HINWEIS: Eine 6 – Well – Platte gut bei 80-90% Konfluenz wird ergeben typischerweise 3,0 – 4,0 x 10 6 Zellen insgesamt. Aspirierendie BMM aus den Wells der 12-Well-Platte verdünnt. Verdünne die Zellen einer Zellsuspension von 3,0 x 10 4 Zellen / ml zu erhalten. Platte 1 ml der Zellsuspension pro Well der 12-Well-Platte. Legen Sie die 12 – Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Transduzieren die iPS – Zellen mit rtTA und Ngn2 Lentiviren (Tag 2) Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf Raumtemperatur. Ergänzung des E8-Medium mit ROCK-Inhibitor und Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL auf die E8 Medium. Auftauen Aliquots mit Lentiviren Suspension. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL auf die Lentivirus Suspension. Saugen Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie 1 ml der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung. Führen Sie die Transduktion mit unterschiedlichen Mengen des rtTA – und Ngn2 -lentivirus Suspensionen. Zum Beispiel transduce die hiPSCs durch Zugabe von 100 & mgr; l sowohl der rtTA -lentivirus und Ngn2 -lentivirus Suspension in eine Vertiefung der 12 – Well – Platte. Für die anderen Brunnen, arbeiten mit 200 & mgr; l, 300 & mgr; l, 400 & mgr; l und 500 & mgr; l Lentiviren Suspension anstelle von 100 ul. Die hiPSCs von zwei Vertiefungen der 12-Well-Platte sollte nicht transduziert werden; sie werden als Kontrollen bei der Auswahl dienen. HINWEIS: Die Transduktionen werden vorzugsweise doppelt durchgeführt, so dass die Transduktionseffizienz genauer nach dem Beginn der Auswahl geschätzt werden kann (Protokollschritt 2.2.4 sehen). Die Menge der lentivirus Suspension, die effizient erforderlich ist, die Mehrheit der hiPSCs zu transduzieren ist abhängig von der Titer der lentivirus Suspension und der hiPSC Linie, die verwendet wird. In dieser Studie verwenden wir in der Regel 100 bis 500 & mgr; l von Lentiviren Suspension auf die hiPSCs transduzieren. Legen Sie die 12-Well-Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 für 6 h. Vor dem Ende der 6 h Inkubationszeit, warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin und 12 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) auf RT. Ergänzen Sie die E8-Medium mit ROCK-Inhibitor. Saugen Sie das E8 Medium ausgegeben. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DPBS. 1 ml der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung. Legen Sie die 12 – Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Aktualisieren Sie die E8 – Medium (Tag 3) Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf RT. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte und 1 mL der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung. Legen Sie die 12 – Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Führen Sie die Auswahl mit Puromycin und G418 (Tag 4 – 8) HINWEIS: In Abhängigkeit von der Zellteilungsrate des Hüftgelenks80% Konfluenz während der Auswahlperiode, an welchem ​​Punkt die Kulturen müssen aufgeteilt werden – SC Linie und die Effizienz der Transduktion lentiviralen können die Zellen 70 erreichen. Weil der Zeitpunkt der Spaltung nicht im Voraus vorhergesagt werden kann, wird es nicht in das Protokoll genannt werden. Anstatt jedoch die E8 Medium mit den angegebenen Konzentrationen von Puromycin und G418 ergänzt Auffrischung kann man die hiPSC Kultur als normale hiPSC Kultur aufgeteilt (einschließlich Plattieren der Zellen auf Vitronectin beschichteten Platten). Die einzige Ausnahme ist, dass die E8 Medium sollte mit den genannten Konzentrationen der Antibiotika ergänzt werden, um die Auswahl fortzusetzen. Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf Raumtemperatur. In Puromycin und G418 zur Auswahl; unterschiedlichen Mengen der Antibiotika während der Selektionsperiode (Tabelle 1) zugegeben. Schätzen die Effizienz der Transduktion durch den Prozentsatz der G418- Abschätzen und Puromycin-resistenten Zellen. Um den Prozentsatz der resistenten Zellen abschätzen zu können, schätzen den Anteil der toten Zellen (nicht-resistenten Zellen) für die verschiedenen Bedingungen (die Kulturen transduziert mit den verschiedenen Mengen an Lentivirus-Suspension) und für die nicht-transduzierten Zellen (die Zellen, die als Auswahlsteuerung dienen). Berechnen Sie den Prozentsatz der resistenten Zellen als [100% – (Anteil der toten Zellen)]. HINWEIS: Wenn die Transduktionen mit den verschiedenen Mengen von Lentiviren Suspension doppelt durchgeführt wurden, kann die Transduktionseffizienz genauer geschätzt werden. Der Zustand mit den nicht-transduzierten Zellen dient als eine Auswahlsteuerung; Der prozentuale Anteil der toten Zellen für die Kulturen mit den verschiedenen Mengen von Lentiviren Suspension niedriger sein sollte, transduziert. Der geschätzte Anteil der resistenten Zellen wird verwendet, um die hiPSCs zu wählen, die für beide Transgene wahrscheinlich positiv sind. Im Allgemeinen wählen wir die hiPSCs aus der Transduktion Zustand waren> 90% der Zelles überleben die 5 d Selektionsperiode. Anzusaugen, das verbrauchte Medium der hiPSCs und 1 mL des hergestellten E8 Medium in die Vertiefungen. Legen Sie die 12 – Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Endkonzentration von G418 Endkonzentration von Puromycin Tag 4 250 & mgr; g / mL 2 & mgr; g / mL Tag 5 250 & mgr; g / mL 2 & mgr; g / mL Tag 6 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL Tag 7 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL Tag 8 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL Tabelle 1: Die Konzentrationen von Antibiotika während der Auswahlperiode. </strong> Konzentrationen des Puromycin und G418 während der 5 d der Selektionsperiode. Stoppen Sie die Auswahl und starten regelmäßige Kultivierung (Tag 9 und höher) Nach 5 d Selektionsperiode, die Kultur rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs normal hiPSCs, mit der Ausnahme , daß das E8 Medium der Zellen mit G418 in einer Endkonzentration von 50 ug / ml und mit Puromycin zu einer Endkonzentration von ergänzt 0,5 & mgr; g / mL. HINWEIS: Die Zellen können nun eingefroren werden (nach Standardprotokollen für die Kryokonservierung von Zellen) als Sicherung dienen. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Reproduzierbarkeit des Differenzierungsprotokoll, weil sie die Verwendung der gleichen Charge von rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs für viele zukünftige Differenzierungsexperimente ermöglicht. 3. Differenzierung von rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs zu Neurons auf 6-wellMEAs und Glasplättchen HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Details zur Differenzierung rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs auf zwei verschiedenen Substraten, dh 6-Well – MEAs (Geräte , bestehend aus sechs unabhängigen Vertiefungen mit 9 – Aufnahme und ein Referenz eingebettet Mikroelektroden pro Vertiefung) und Glasplättchen in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Die Protokolle können jedoch leicht für größere Substrate angepaßt werden (beispielsweise für die Vertiefungen von 12- oder 6-Well – Platten), indem man die genannten Werte Scaling – up nach der Oberfläche. Bereiten Sie die MEAs oder Glasplättchen (Tag 0 und Tag 1) Am Tag vor dem Beginn der Differenzierung, sterilisieren die MEAs gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Verdünne das Adhäsionsprotein Poly-L-Ornithin (PLO) in sterilem Reinstwasser auf eine Endkonzentration 50 ug / mL. Bestreichen Sie die aktive Elektrodenfläche von 6-Well-MEAs durch eine 100 & mgr; l platzierenin jeder Vertiefung fallen der verdünnten PLO. Legen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen der 24-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette. Hinzufügen 800 & mgr; l der verdünnten PLO in jeder Vertiefung. Verhindern Sie die Deckgläser Aufschwimmen von ihnen nach unten mit dem 1000 ul Pipettenspitze schieben. Inkubieren Sie die 6-Well – MEAs und 24-Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Am nächsten Tag absaugen verdünnt PLO. Waschen Sie die Glasflächen der 6-Well-MEAs und die Deckgläser zweimal mit sterilem Reinstwasser. Verdünnte Laminin in kaltem DMEM / F12 bis zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml (für die 6-well MEAs) und 10 & mgr; g / ml (für die Deckgläser). Unmittelbar coat die aktive Elektrodenfläche der 6-well MEAs durch eine 100 & mgr; l Tropfen in jede Vertiefung setzt. In ähnlicher Weise werden 400 & mgr; l des verdünnten Laminin in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte zu beschichten die Deckgläser. Verhindern Sie die Deckgläser Aufschwimmen von ihnen nach unten mit dem 1000 ul Pipettenspitze schieben. Inkubieren der 6-well MEAs und 24 – Well – Platte in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für mindestens 2 h. Platte , die die hiPSCs (Tag 1) HINWEIS: Die Volumina , die in den Schritten 3.2.1 erwähnt – 3.2.4 annehmen , daß die rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs in einer 6-Well Platte kultiviert werden und daß die Zellen von einer gut geerntet werden. Die Volumina, die für die Plattierung der Zellen auf den 6-well MEAs und / oder die Deckgläser, hängt von der Anzahl der 6-well MEAs und / oder die Anzahl der Deckplättchen erforderlich sind, die in dem Experiment verwendet werden; die Zahlen in Schritten angegeben 3.2.6 – 3.2.8 erlauben unterschiedliche Experiment Größen skalieren. Warmen DMEM / F12, CDS und E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin zu R / T. In Doxycyclin zu einer Endkonzentration von 4 ug / ml und ROCK-Inhibitor zur E8 Medium. Saugen Sie das verbrauchte Medium der rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs und fügen 1 mL CDS auf die hiPSCs. Inkubieren von 3 bis 5 min in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Prüfen unter dem Mikroskop, ob die Zellen voneinander Lösen werden. In 2 ml DMEM / F12 in den Brunnen, zu suspendieren die Zellen vorsichtig mit einem 1000 ul Pipette und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Röhrchen. 7 ml DMEM / F12 zu der Zellsuspension. Dreh die Zellen bei 200 · g für 5 min. Den Überstand aspirieren und 2 mL des E8-Medium hergestellt. Distanzieren die hiPSCs durch die Spitze eines 1000 ul Pipette gegen die Seite des 15-ml-Röhrchen setzen und Resuspendieren der sanft Zellen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelöst sind. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer. HINWEIS: Eine 6-Well – Platte gut bei 80-90% Konfluenz wird ergeben typischerweise 3,0 – 4,0 x 10 6 Zellen insgesamt. Saugen Sie das verdünnte Laminin. Für die 6-Well-MEAs, verdünnte die Zellen eine ce zu erhaltenll Suspension von 7,5 x 10 5 Zellen / mL. Platte, die Zellen durch einen Tropfen von 100 & mgr; l der Zellsuspension auf der aktiven Elektrodenfläche in jeder Vertiefung der 6-Well-MEAs Zugabe. Für die Deckgläser, verdünne die Zellen einer Zellsuspension von 4,0 x 10 4 Zellen / ml erhalten. Platte die Zellen durch Zugabe von 500 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen. HINWEIS: Der letzte auf den MEAs Zelldichte höher als auf den Deckgläsern (1A und B). Wir fanden heraus, dass diese hohe Zelldichte für die ordnungsgemäße Erfassung der Netzwerkaktivität erforderlich war. In dem Protokoll werden die Zahlen vorgesehen, die für die Assays optimal erwiesen. Platzieren Sie die 6-well MEAs und 24 – Well – Platte in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 2 h (MEAs) oder O / N (24 – Well – Platte). Nach 2 h, fügen Sie vorsichtig 500 ul der hergestellten E8 Medium zu jeder Vertiefung der 6-Well-MEAs. Legen Sie die 6-wirll MEAs O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Ändern Sie das Medium (Tag 2) DMEM / F12 mit 1% (v / v) N-2 Supplement, 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin Am nächsten Tag vorzubereiten. Hinzufügen humanes rekombinantes Neurotrophin-3 (NT-3) bis zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml, humanes rekombinantes brain-derived neurotrophic factor (BDNF) bis zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Wärmen Sie das Medium auf 37 ° C. Hinzufügen Laminin auf eine Endkonzentration von 0,2 & mgr; g / mL zu dem Medium. Filtern des resultierenden Mediums. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Inkubieren Sie die 6-Well – MEAs und 24-Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. In Ratte Astrozyten (Tag 3) <br/> Hinweis: Die Volumina , die in diesem Protokoll erwähnt werden , davon ausgehen , dass die Ratte Astrozyten in T75 Kulturflaschen kultiviert werden. Es ist entscheidend, dass die Ratten-Astrozyten, die zu den Kulturen gegeben werden, sind von guter Qualität. Wir verwenden zwei Kriterien zu prüfen, ob die Ratte Astrozyten von guter Qualität sind. Erstens sollte die Ratte Astrozyten Kultur der Lage sein, konfluent wachsen innerhalb von zehn Tagen nach der Isolierung von den Ratten embryonalen Gehirn. Zweitens, nachdem die Ratte astrocyte Kultur Aufspalten sollten die Ratten – Astrocyten Lage sein, eine konfluente, tessellated Monoschicht (1C) zu bilden. Wenn die Ratte Astrozyten Kultur diese beiden Kriterien nicht erfüllt, empfehlen wir diese Kultur nicht zur Differenzierung Experimente zu verwenden. Warm 0,05% Trypsin-EDTA auf RT. Warm die DPBS und DMEM / F12 mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf 37 ° C. Saugen Sie das verbrauchte Medium der Ratte Astrozyten Kultur. Waschen Sie die Kultur durch Zugabe von 5 ml DPBS und swish es um sanft. Aspirdie DPBS aß und mit 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA. Swish die Trypsin-EDTA um sanft. Inkubieren in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 5 – 10 min. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen abgelöst werden. Lösen Sie die letzten Zellen, die durch den Kolben ein paar Mal zu treffen. 5 ml DMEM / F12 in den Kolben. Verreiben die Zellen sanft im Inneren des Kolbens mit einer Pipette 10 ml. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Röhrchen. Drehen Sie das Rohr bei 200 g für 8 min. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 1 ml DMEM / F12. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer. 7.5 x 10 4 Astrozyten pro Vertiefung der 6-Well – MEAs. In 2,0 x 10 4 Astrozyten pro Vertiefung der 24-Well – Platte. Inkubieren Sie die MEAs und die 24-Well – Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Ändern Sie das Medium (Tag 4) <li> Bereiten Neurobasal-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement, 1% (v / v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin. Hinzufügen, NT-3 zu einer Endkonzentration von 10 ng / mL, BDNF auf eine Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Zusätzlich Cytosin β-D-arabinofuranosid zu einer Konzentration von 2 uM hinzuzufügen. HINWEIS: Cytosin β-D-arabinofuranoside wird zu dem Medium gegeben Astrozytenproliferation zu hemmen und die verbleibenden hiPSCs zu töten, die nicht in die Neuronen zu differenzieren. Filtern des Mediums und erwärme auf 37 ° C. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Pflegen Sie die 6-Well – MEAs und die 24-Well – Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Aktualisieren Sie das Medium (Tag 6 – 28) HINWEIS: Beim Start von Tag 6, aktualisieren Sie die Hälftealle zwei Tage des Mediums. Von Tag 10 an wird das Medium mit FBS die Astrozyten Lebensfähigkeit zu unterstützen. Bereiten Neurobasal-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement, 1% (v / v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin. Hinzufügen, NT-3 zu einer Endkonzentration von 10 ng / mL, BDNF auf eine Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Vom ersten Tag ab 10, ergänzen auch das Medium mit 2,5% (v / v) FBS. Filtern des resultierenden Mediums und erwärme auf 37 ° C. Entfernen Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und der 24-Well-Platte mit einer 1000 ul Pipette und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Pflegen Sie die 6-Well – MEAs und die 24-Well – Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. 4. Stellen Sie die neurophysiologische Profil von hiPSC abgeleiteten Neurone HINWEIS: Zwei bis drei Wochen nach der inProduktion der Differenzierung können die hiPSC abgeleiteten Neuronen für verschiedene Downstream-Analysen verwendet werden. In diesem Abschnitt werden Beispiele für einige Downstream-Analysen gegeben, die durchgeführt werden können, die neurophysiologischen Profil der hiPSC abgeleiteten Neuronen zu etablieren. Charakterisieren Sie die neuronale Netzwerkaktivität unter Verwendung von MEAs Nehmen Sie 20 Minuten von elektrophysiologische Aktivität von hiPSC abgeleiteten Neuronen kultiviert auf MEAs. Während der Aufzeichnung, daß die Temperatur bei 37 ° C, und die Verdampfung und die pH – Änderungen des Mediums zu verhindern , indem eine konstante, langsame Strömung der befeuchteten Gas Aufpumpen (5% CO 2, 20% O 2, 75% N 2) auf die MEA . Nach 1200X Verstärkung (MEA 1060, MCS), probieren Sie das Signal bei 10 kHz die MCS Datenerfassungskarte. Analysieren Sie die Daten (Spike und Burst – Erkennung) unter Verwendung eines kundenspezifischen Software – Paket 23. Charakterisieren Sie die Einzelzellen – elektrophysiologische Aktivität </strong> Übertragen Sie die Deckgläser, die hiPSC abgeleiteten neuronalen Kulturen zu einem getauchten Feststufigen Aufnahmekammer in einem aufrechten Mikroskop enthält. Nehmen Sie 20 Minuten der spontanen Aktionspotential evozierten postsynaptischen Ströme (sEPSC) 24. Ermitteln Sie die synaptische Ereignis mit neurowissenschaftlichen Programm. Charakterisieren Sie die neuronale Morphologie und Synapsin Ausdruck Fix und färben die hiPSC abgeleiteten Neuronen für MAP2, Synapsin-1/2 und PSD-95 22, 24, 25. Quantifizierung die Anzahl der Synapsin-1/2 und PSD-95 puncta unter Verwendung von Bildanalysesoftware.