Imunocoramento Secções biocitina-preenchidos e processados ​​para neuroquímicos Markers

O cérebro é conhecido pela diversidade das características estruturais e funcionais dos seus elementos neuronais individuais. Compreender os papéis de tipos neuronais distintas na função cerebral e patologia exige caracterização e identificação inequívoca dos neurônios. Estruturalmente, as características morfológicas definidos pela localização somato-dendrítica determinar as potenciais entradas que um determinado neurônio recebe, enquanto o padrão de arborização axonal identifica alvos potenciais pós-sinápticos. A diversidade estrutural dos neurônios tem sido apreciado desde os dias de estudos histológicos seminais do Ramón y Cajal ^1. O advento das técnicas de gravação de uma única célula revelou que os neurônios estruturalmente distintos também mostram diferenças nos padrões de disparo e características sinápticas. A diversidade na estrutura e fisiologia é particularmente evidente em GABAérgicos neurónios inibitórios ^2,3. Além disso, tornou-se cada vez mais evidente que structurallneurônios semelhantes y podem expressar diferentes marcadores neuroquímicos e mostrar correspondentes diferenças funcionais ^4. Da mesma forma, os neurónios com os mesmos marcadores neuroquímicos podem ter estruturas e funções distintas ^5-10. Assim, na prática, a análise das características funcionais de neurónios e o seu papel na rede requer a definição ambas as identidades morfológicas e neuroquímicas. Mesmo com o advento de linhas de ratinhos repórter segmentação marcadores neuroquímicos específicos, muitas vezes é necessário para determinar a morfologia e a identidade subtipo baseado em ¹¹ imunohistologia.

O método padrão utilizado para caracterizar células registrados em fatias cerebrais agudas é para os encher biocitina ou neurobiotin durante a gravação, corrigir as seções de paraformaldeído (PFA), seguindo as gravações, e usar a imunohistoquímica para revelar a morfologia e neuroquímica. Uma vez que a espessura das secções para a fisiologia fatia são tipicamente 300 mmou mais, e porque a maioria dos anticorpos não conseguem penetrar todo o caminho através do que a profundidade, as fatias devem ser re-seccionados a 60 um ou menos, para permitir a imunocoloração simultânea para biocitina e marcadores neuroquímicos ^12-14. Infelizmente, é trabalhoso ressecção; corre o risco de perda de tecido durante o corte; e pode conduzir a diferenças de encolhimento do tecido, o que complica reconstruções morfológicas. Além disso, o conhecimento prévio da morfologia poderia ajudar a diminuir os marcadores candidatos que são susceptíveis de ser expressa pelas células. Temos modificado os protocolos imunohistologia biocitina padrão para permitir o processamento em série de secções em primeiro lugar para a recuperação de morfologia e, em seguida, para a identificação de potenciais marcadores neuroquímicos.

A imuno-histoquímica é o estudo de distribuição de antigénio em células ou tecidos e pode ser visualizada utilizando uma enzima, marcadores fluorescentes, elementos radioactivos, ou partículas coloidais de ouro ^15. O procedimento involves usando anticorpos primários para marcar especificamente e amplificar um ou mais antigénios específicos, seguido pela utilização de anticorpos secundários fluorescentes segmentação do anticorpo primário para visualização. Devido à necessidade de diferenciar os espectros de fluorescência de cada anticorpo secundário sem sobreposição, apenas um número limitado de antigénios podem ser examinados simultaneamente. Assim, o conhecimento prévio da morfologia poderiam ser úteis para seleccionar os marcadores neuroquímicos candidatos para a classificação de células. Conceptualmente, a razão de processamento em série de secções coradas já baseia-se na premissa de que imunomarcação para uma proteína ou péptido não deve interferir com a antigenicidade e imunomarcação subsequente para um péptido estruturalmente independente ^16. Esta falta de interferência é devido à ligação dos anticorpos para um epítopo da proteína específica num antigénio e, portanto, permite a coloração simultânea de múltiplos antigénios no mesmo tecido. O número de antigénios revealed por imunocoloração é limitada pela necessidade de espectros de não sobreposição dos anticorpos secundários fluorescentes e pela necessidade de direccionar antigénios individuais com anticorpos criados em diferentes espécies de modo a eliminar a reactividade cruzada ^17,18. Enquanto este é o raciocínio por trás de rotulagem de série em vez de em simultâneo com dois anticorpos diferentes que podem interagir, a nosso conhecimento, imunocoloração para um segundo antigénio não foi relatado após a conclusão da imunomarcação para um ou mais antígenos em seções montadas. Aqui, descrevemos um método para imuno série de secções previamente coradas e montadas. Embora pormenor este processo para um processo de imunomarcação de série para a recuperação da morfologia seguido por coloração para marcadores de proteína / péptido em secções espessas, os mesmos procedimentos podem ser usados ​​no padrão, secções histológicas finas bem. Além disso, descreve-se uma abordagem prática para encher neurónios gravados com biocitina e o processo para desalojar oeléctrodo da célula após a conclusão de gravações para optimizar o enchimento do axonal e mandris dendríticas de neurónios, tal como apresentado na nossa recente ^6,8 trabalho.

A vantagem mais importante do processo aqui descrito é que a morfologia da célula gravado pode ser totalmente recuperado e fotografada antes de tentar a ressecção ou imunocoloração das fatias. Embora os problemas com a penetração de determinados anticorpos podem tornar necessária a fatias de ressecção para imunocoloração secundário, os procedimentos detalhados aqui iria eliminar a necessidade de reconstruir neurónios complexos de múltiplas secções e evitar problemas devido à perda de tecido e o encolhimento diferencial, o que pode comprometer a reconstrução seguinte ressecção. Uma vantagem adicional é que o processo irá reduzir custos, tempo, esforço e anticorpos caros, limitando imunocoloração e re-corte às fatias em que os neurônios-cheia biocitina são recuperados. O aspecto mais prático é o anúncioimunocoloração nal que pode ser realizada em secções coradas meses antes de usar a técnica acima mencionada. Em particular, a recuperação da morfologia reduziria consideravelmente o potencial que os dados fisiológicos das células é rejeitado devido a uma incapacidade para obter uma caracterização morfológica básica do tipo de célula.