La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles.
A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes 1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.
Introduction
inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales 2,3. Por el contrario, los sistemas basados en Raman tienen picos de emisión mucho más estrechas que resultan en las capacidades de multiplexación mejoradas con fuentes que afirman la detección simultánea de hasta 100 analitos 2,3.
Muchas fuentes bibliográficas están disponibles que cubren aspectos importantes relacionados con inmunoensayos 4 – 6, como paso a pasodetalles para crear kits ELISA personalizadas. Desafortunadamente, estos protocolos son para la detección fluorescente o colorimétrico, lo que limita la capacidad de multiplexación de inmunoensayos personalizados. Para hacer frente a esta necesidad, se presenta un procedimiento detallado para fabricar el / Raman inmunoensayo UV-Vis previamente publicado 7 para un inmunoensayo directo como se ilustra en la Figura 1B.
Este protocolo incluye la fabricación de sondas basados en nanopartículas de oro funcionalizada, que se ilustra en la Figura 2. El procedimiento para hacer las sondas / UV-Vis Raman comienza por reporteros Raman unión a la superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs son entonces funcionalizados con anticuerpos que se asocian con polietilenglicol (PEG). sitios de unión restantes en la AuNPs se bloquean por la unión de tiol metoxi polietilenglicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar la posterior unión no específica durante el análisis. Las sondas AUNP preparados se prueban mediante la unión a antígenosfijado a los pocillos de una placa de poliestireno, como se ilustra en la Figura 1B. Tras lavar la placa, las sondas AUNP se detectan utilizando espectroscopia UV-Vis, mientras que los reporteros Raman asociados se detectan con la espectroscopia Raman. La combinación de datos UV-Vis y espectral Raman proporciona dos métodos de análisis, la mejora de las capacidades de este inmunoensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superfic…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
Referenzen
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