JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biotechnik

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Published: December 13, 2016
doi:
10.3791/54785
, , , , ,
1Bristol Centre for Functional Nanomaterials,University of Bristol, 2Department of Materials,Imperial College London, 3Self Assembly Group,CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine,University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory,University of Bristol

Summary

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Abstract

יישומים ביו רבים וחשובים, כגון הדמית תא מניפולציה מרחוק, ניתן להשיג על ידי תיוג תאים עם חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs). השיג ספיגת הסלולר מספקת של SPIONs הוא אתגר כי כבר נפגש באופן מסורתי על ידי חשיפת תאים לריכוזים מוגברים של SPIONs או על ידי הארכת זמן חשיפה (עד 72 שעות). עם זאת, אסטרטגיות אלה צפויות לתווך רעילים. כאן, אנו מציגים את הסינתזה של magnetoferritin SPION מבוסס חלבון וכן פרוטוקול functionalization משטח קליל המאפשר המגנטיזציה תאים מהירה באמצעות ריכוזים בחשיפה נמוכים. ליבת SPION של magnetoferritin מורכב של תחמוצת ברזל מסומם-קובלט עם קוטר חלקיקים ממוצע של mineralized 8.2 ננומטר בתוך החלל-פריטין apo סוס טחול. cationization הכימי של magnetoferritin מיוצר רומן, SPION הקרום פעיל מאוד כי ממוגנט אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSCs) באמצעות פעמי דגירה כמוקצר ככל ריכוזים דקים וברזל אחד כמו שפל כמו 0.2 מ"מ.

Introduction

משטח מחייב או הפנמה של חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) אפשר המגנטיזציה של מגוון סוגי תאים עבור יישומים כגון הדמית מניפולציה מרחוק. 1 עם זאת, השגת המגנטיזציה הסלולר מספיק יכולה להיות אתגר, במיוחד כאשר האינטראקציה בין SPION ואת פני התא חלשה. 2 בעבר, או חשיפה ממושכת לריכוזים גבוהים SPION כבר מועסק אסטרטגיות כדי להתגבר על האתגר הזה. 3,4 עם זאת, אסטרטגיות אלה הם בעייתיים משום שהם להגדיל רעילות 5,6 ויש הצלחה מאוד מוגבלת בסוגי תאים עם שיעורי הפנמה נמוכה, כגון לימפוציטים. 7 כדי לשפר ספיגת הסלולר של SPIONs, מספר גישות functionalization משטח נחקרו. למשל, נוגדנים שימשו לקדם אנדוציטוזה קולטן בתיווך, 8 תוך ספיגת הלא ספציפית יכולה להיות מושגת באמצעות transfectionרבותי 9,10 או מינים חודר תאים, כגון פפטיד-מידה HIV. 11,12 עם זאת, נוגדן וגישות functionalization פפטיד מוגבלים על ידי ריאגנטים יקרים והכנת סינתטי מורכבת, תוך סוכני transfection יכולים לגרום ממטרי nanoparticle ולהשפיע לרעה על תפקוד תא. 13,14

אנחנו דיווחנו לאחרונה על הסינתזה של magnetoferritin cationized הכימי, SPION רומן שהיה יעיל מאוד בתאי גזע mesenchymal אדם magnetizing (hMSCs) באמצעות פעמי דגירה קצרות ככל דקה אחת. 15 Magnetoferritin מסונתז על ידי ומשחזר SPION בתוך חלל mineralized-דה של פריטין חלבון אחסון ברזל. 16 זה SPION מבוסס החלבון המשלב תכונות רבות שהופכות אותו מתאים במיוחד עבור המגנטיזציה תא, כגון שליטה על התכונות המגנטיות של הליבה המגנטית, 17-19 ו biocompatibility ו מסיסות מימית שמעניקות מעטפת החלבון. נוסףיותר, functionalization השטח מושגת בקלות בשל חומצות אמינו addressable שיכול להיות 20-22 או גנטית שינוי כימי. 23-25 הראינו כי cationization הכימי של שאריות חומצת אמינו החומצית של פגז החלבון מייצר ננו-חלקיקים יציבים כי ייקשרו בקלות עם תחומי anionic על פני התא מוביל המגנטיזציה תאים מהירה ומתמשכת. הליך זה מבטל את צורך functionalization המייגע ופרוטוקולי דגירה ארוכים, ובשל מנגנון התיוג הלא ספציפית אסטרטגית המגנטיזציה המהירה הזה צריכה למצוא יישום רחב היקף של סוגי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים עומק בדו"ח של שיטת תיוג תא אולטרה מהיר, כולל פרוטוקולים מפורטים של סינתזה, functionalization טיהור השטח של magnetoferritin cationized.

Protocol

אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) נבצרו ממח עצם ירך העצם הפרוקסימלי של חולי osteoarthritic שעברו ניתוח החלפת מפרק ירך, בהתאם מלא עם הנחיות ועדת אתיקת מחקר חולי Southmead בריסטול (הפניה # 078/01) ולאחר הסכמת המטופל הושגה. 1. סינתזה Magnetoferritin וטיהור הערות כלליות בצע סינתזת magnetoferritin בתוך כלי תגובת סגר, פעמים במקטורן על 65 מעלות צלזיוס תחת אווירת חנקן להגביל חמצון של מבשרי המתכת. להזריק פתרונות מלח מתכת מי חמצן דרך נמלי גישה במכסה לתוך כלי התגובה באמצעות משאבת מזרק. לאחר סינתזה magnetoferritin, לטהר את החלבון על ידי כרומטוגרפיה-אניוני (ראה סעיף 1.4) כדי להסיר חלקיקים לא מגודר בתוך חלל חלבון, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה (ראה סעיף 1.5) כדי לבודד מונומרים חלבון. דהריכוז termine חלבון באמצעות assay ברדפורד (ראה סעיף 1.6). הכנות לקראת סינתזה Deoxygenate 500 מ"ל מים ללא יונים על ידי הנחת צינור מחובר בלון גז חנקן במים, איטום כלי בניילון ומבעבעים דרך גז חנקן כ -60 דקות. מחממים באמבט מים המחובר כלי התגובה כפול במעיל עד 65 מעלות צלזיוס. הוסף 75 מ"ל של 50 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ (pH 8.6) לתוך כלי התגובה, לאטום את כלי השיט, deoxygenate ידי מבעבע גז חנקן דרך הפתרון חיץ עבור כ 20 דקות. במקביל, מערבבי פתרון החיץ באמצעות בוחש מגנטי. לאחר deoxygenating פתרון חיץ HEPES, להסיר את הצינור באספקת גז החנקן מן המאגר ולשמור אותו מרחפי הספינה כדי לשמור על אווירת חנקן. להוסיף apo-פריטין כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ 'l. המשך בחישה מגנטית, אך להפחית את מהירות ערבוב אם הקצפה מתרחשת. הכן פתרון המניות 25 מ"מ של heptahydrate סולפט קובלט ידי המסת 0.19 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים deoxygenated. הכן פתרון 25 מ"מ של פתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ידי המסת 0.98 גרם ב 100 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated. הסר 2.5 מ"ל של הפתרון hexahydrate סולפט ברזל אמוניום ולהחליף עם 2.5 מ"ל של heptahydrate סולפט קובלט. הכן פתרון 8.33 מ"מ של מי חמצן במים deionized deoxygenated ידי הוספת הראשונה 965 μl של פתרון מי חמצן (30% w / w) עד 9 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של תת-המניה הזו ל -99 מ"ל מים ללא יונים deoxygenated. סינתזת Magnetoferritin להזריק 10.1 מ"ל של הן מבשר ברזל-קובלט ואת מי חמצן בעת ​​ובעונה אחת לתוך התמיסה apo-פריטין (מגנטית stirred) בקצב זרימה של 0.15 מ"ל / דקה באמצעות שני משאבת מזרק (הנפח הכולל מוזרק: 20.2 מ"ל). בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים. הערה: התוכן של כלי התגובה בהדרגה לאמץ בצבע חום כהה כמו תמורת התגובה. זמן קצר לפני השלמת הזריקה הראשונה, להכין עוד 100 מ"ל של מבשר ברזל-קובלט פתרון מי חמצן באמצעות מים ללא יונים טרי deoxygenated. חזור על שלב ההזרקה מתואר 1.3.1 באמצעות פתרונות מוכנים טרי של קובלט-הברזל מי חמצן. בתקופת הזרקת, deoxygenate עוד 500 מ"ל מים ללא יונים, והמשך כמתואר ב 1.3.3 ו 1.3.4. לאחר הזריקה השלישית, לעזוב הפתרון להבשיל במשך 15 דקות תחת בחישה. הוסף 1.5 מ"ל של פתרון ציטראט 1 M נתרן לכלי השיט כתגובה Chelate יוני מתכת חינם בתמיסה. הסר את הפתרון מן התגובהכלי לתוך צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות, צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 4,350 XG ולהעביר את supernatant דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר. בשלב זה, את supernatant המסונן ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לטיהור. כרומטוגרפיה חילוף יונים טען את המדגם על עמודה (בקוטר 2.5 ס"מ, 20 ס"מ) המכילות מטריצה ​​קטיוני באמצעות משאבת peristaltic בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה. לשטוף את העמודה עם כ 100 מ"ל של הפעלת המאגר (50 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) חיץ, pH 8.0) באמצעות משאבת שיפוע בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה. כדי elute החלבון, לשטוף את הטור 10 מיליליטר / דקה עם ריכוזים גוברים של נתרן כלורי (NaCl) במאגר טריס: 150, 500 ו -1,000 מ"מ סופי ריכוז NaCl, 150 מיליליטר של כל ריכוז. כמו חלבון elutes בריכוז NaCl של 500 מ"מ, לאסוף אותו ב -50 שברים מ"ל באמצעות אספן חלק אוטומטי. הערה: עבורפרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה חילוף יונים להתייעץ פרוטוקולים שפורסמו בעבר. 26 כרומטוגרפיה הדרת גודל לרכז את 150 מ"ל של magnetoferritin לנפח של כ 2 מ"ל באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 15 מ"ל ואחריו ביחידת נפח 4 מ"ל. עיין בהוראות היצרן של יחידות מסנן צנטריפוגלי (ראה רשימת חומר) עבור פרוטוקול מפורט של הליך זה. טען המדגם מרוכז על עמודת סינון ג'ל באמצעות לולאת הזרקה. לשטוף את העמודה עם חיץ ריצה (50 מ"מ טריס חיץ, 8.0 pH, המכיל 150 מ"מ NaCl) בקצב זרימה של 1.3 mL / min. אסוף 6 מ"ל שברים באמצעות אספן חלק אוטומטי. מונומרים חלבון elute אחרונים. בשלב זה, magnetoferritin מטוהרים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד cationization. הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט של כרומטוגרפיה גודל הרחקה באמצעות טור סינון ג'ל להתייעץ previously שפורסם פרוטוקולים. 27 קביעת ריכוז חלבון הכן סטנדרטים פריטין של 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 ו 1 מ"ג / מ"ל ​​ב 50 חיץ מ"מ טריס באמצעות פריטין הטחול סוס זמינים מסחרית. הערה: ריכוז החלבון של פריטין הזמין מסחרי נאמרה על הבקבוק. אם לא, פנה לספק את המידע הזה. לדלל דגימות magnetoferritin של ריכוז ידוע ב 50 מ"מ טריס חיץ עד שהצבע של הפתרון כ תואם את הצבע של התקן 0.5 מ"ג / מ"ל. רשום לעצמך גורם לדילול. הוסף 10 μl של כל דגימה סטנדרטית magnetoferritin בשלושת עותקים לתוך בארות של צלחת 96 באר. הוסף 200 μl של מגיב מוכן ברדפורד היטב כל (עיין ברשימת חומרים לפרטים מגיבים assay ברדפורד). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות. מדוד את הספיגה ב λ = 595 ננומטר באמצעותקורא microplate. מגרש את ספיגת הממוצע של סטנדרטי פריטין כפונקציה של ריכוז חלבון ולהשתמש המדרון ליירט של ההתאמה ליניארית כדי לחשב את הריכוז של מדגם magnetoferritin. הערה: קח בחשבון את גורם לדילול ששימש להתאים המדגם magnetoferritin אל עקומת סטנדרט. 2. Magnetoferritin Cationization הערות כלליות הערה: לקבלת magnetoferritin cationization, N, N–dimethyl 1,3-propanediamine (DMPA) היה מצמידים את שאריות חומצה אספרטית גלוטמית על פני השטח MF באמצעות N – (3-dimethylaminopropyl) – הידרוכלוריד -ethylcarbodiimide 'N (EDC). לבצע את התגובה בטמפרטורת החדר תחת בחישה. פרוטוקול כדלקמן הוא עבור cationization של 10 מ"ג של magnetoferritin בהיקף כולל של 5 מ"ל (ריכוז החלבון 2 מ"ג / מ"ל). עם זאת, קנה המידה כלפי מעלה או מטהעל ידי שמירה על חלבון: DMPA: יחסי EDC עקבי, כמו גם כרכים של פתרון חיץ magnetoferritin. לפני התגובה cationization, dialyze דגימות magnetoferritin למאגר פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 mM NaCl. זה חשוב להסיר חיץ elution טריס ולהימנע תגובות לא רצויות בין אמין טריס ואת שאריות EDC המופעל חומצה קרבוקסילית. קביעת ריכוז חלבון לאחר דיאליזה ולהתאימו 4 מ"ג / מ"ל ​​לפני cationization. פרוטוקול Cationization תשקלי 374 מ"ג של DMPA ו להתמוסס 2.5 מ"ל של 200 מ"מ 2 חומצה ethanesulfonic (N -morpholino) (MES) חיץ. התאם את ה- pH הפתרון כ 7 באמצעות מרוכז (6 M) חומצה הידרוכלורית (HCl). זהירות: בצע פעולה זו במנדף, כמו תוספת של חומצה כדי DMPA משחרר אדים רעילים! להוסיף 2.5 מ"ל של תמיסת magnetoferritin ב 4 מ"ג / מ"ל ​​(concen הסופיtration של MES הוא 100 מ"מ, הריכוז הסופי של magnetoferritin הוא 2 מ"ג / מ"ל, הסכום הכולל של חלבון הוא 10 מ"ג). הוספת בוחש מגנטי ומערבבים במשך שעה 2. לאזן. בזהירות לכוון הפתרון 5.0 pH באמצעות 1 M HCl. להוסיף 141 מ"ג של אבקת EDC לפתרון DMPA / magnetoferritin. המשך ערבוב במשך 3.5 שעות. סנן את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל משקעים. מוסיפים את הפתרון צינורות דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי 12-14 kDa ו dialyze נגד 4 ליטר של חיץ פוספט 50 מ"מ (pH 7) המכיל 50 מ"מ NaCl עבור 2 ימים על 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ דיאליזה לפחות שלושה פעמים במהלך אותה תקופה. הערה: בשלב זה, cationized magnetoferritin יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. 3. תיוג תא גזע האדם mesenchymal עם Cationized Magnetoferritin הערות כלליות <li> בצע את כל תרבית התאים באמצעות ארונות זרימה למינרית בכיתה שנייה וחממות humidified על 37 מעלות צלזיוס ואווירת פחמן דו חמצני 5%. התרבות תאים כמו monolayers באמצעות 175 ס"מ 2 צלוחיות 20 מ"ל של מדיום תרבות, אשר מתחדש כל 3 – 4 ימים. בינוני תרבות מורכב הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), המכיל 1,000 מ"ג / גלוקוז L, 10% (V / V) בסרום שור עוברי, 1% (v / v) פניצילין / פתרון סטרפטומיצין, 1% (v / v) L -alanyl-L- גלוטמין פתרון 5 ng / ml גורם הגדילה פיברובלסטים אדם טרי בתוספת. תיוג מגנטי של hMSC עם magnetoferritin cationized זרע 150,000 hMSCs לתוך 25 ס"מ 2 צלוחיות ולהשאיר לדבוק לילה בשעה 37 ° C. סנן לעקר magnetoferritin cationized דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר ולקבוע את ריכוז החלבון. שמירה על תנאים סטריליים, להכין פתרון 0.5 מיקרומטר של magnetoferri cationizedפח ב פוספט שנאגר מלוח (PBS). שמור כתרים במנדף תרבות סטרילי עד השימוש. שוטפים את התאים מצופה עם 2 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר. הוסף 1 מ"ל של הפתרון magnetoferritin cationized מעוקר אל התאים מצופה דגירה במשך פרק הזמן הרצוי (1 דקות עד 1 שעה). שטוף תאים עם PBS, ולאחר מכן תאי קציר על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של חומצת טריפסין / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות להשבית טריפסין / EDTA, להעביר הפתרון צינור צנטריפוגות 15 מ"ל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 524 x. בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלול ב 0.5 מיליליטר חיץ הפרדה מגנטי, מורכב 0.5% (w / v) בסרום שור עוברי 2 mM EDTA ב PBS. פרדת תא מגנטית צרף המגנט אל הדוכן הרב, ולהוסיף עמודת פרדת מגנטי המגנט. מקום מסנן שלפני פרידה על הבעמודה E. מניח 0.5 מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטי במסנן שלפני הפרידה ולתת לו לרוץ דרך שני המסנן בעמודה לכבס להרטיב אותם. מניחים צינור צנטריפוגות 15 מ"ל תחת העמודה. הוסף 0.5 מיליליטר של השעית תא מאגר מסנן טור הפרדה המגנטית. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי. כאשר המאגר ריק, להוסיף 0.5 מיליליטר נוסף של חיץ הפרדה מגנטי. חזור עוד פעם אחת (הנפח הכולל של חיץ הפרדה מגנטי המשמש לשטיפה צריך להיות 1.5 מיליליטר). שלב זה לשטוף elutes כל התאים הלא-ממוגנטים מהעמודה (שבריר של התאים הלא-ממוגנטים). הסר את העמודה מן המגנט ולמקם אותו צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר טרי. הסר מסנן ממאגר העמודה. הוסף 1 מ"ל של חיץ הפרדה מגנטי המאגר ומיד לדחוף דרך העמודה באמצעות הבוכנה מסופק על ידי ייצורr. זה elutes התאים הממוגנטים מהעמודה לתוך צינור צנטריפוגות (חלק תא ממוגנט). צנטריפוגה שני צינורות במשך 5 דקות ב 524 x ז. בטל supernatant מחדש להשעות את כדורי תא 0.3 מ"ל PBS. ספירת מספרי תאים בכל שבריר באמצעות hemocytometer. לקבוע את החלק היחסי של תאים ממוגנטים, M (%), באמצעות המשוואה הבאה: כאשר n (M) הוא מספר תאים בשבריר הממוגנט n (M + NM) הוא הסכום של מספר התאים שהברים הממוגנטים והלא-ממוגנטים. הכנת hMSCs שכותרתו עם magnetoferritin cationized כימות ברזל באמצעות ספקטרוסקופית פליטה אופטי פלזמה מצמידים אינדוקטיבי (ICP-OES) הערה: הפרוטוקול ייתכן שיהיה צורך מותאם למכשירי ICP-OES אחרים. מומלץ להתייעץ עם מחדשטכנאי sponsible. צנטריפוגה מספר ידוע של תאים למשך 5 דקות ב 524 x גרם. הסר את supernatant PBS ולהוסיף 0.25 מ"ל של 50% (v / v) חומצה חנקתית. וורטקס לערבב את ההשעיה תא acidified. דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. להוסיף 4.75 מ"ל של מים מזוקקים לכל תערובת מדגם ו מערבולת. לנתח עם ICP-OES. 28 לנרמל את תכולת הברזל נמדדה למספר התאים כדי לקבוע ערך עבור תוכן ברזל הסלולר.

Representative Results

TEM שימש כדי לאשר מינרליזציה ננו-חלקיקים בתוך חלל apoferritin ולקבוע את גודל הליבה הממוצע (איורים 1 א ו -1 B). ניתוח תמונה של דגימות magnetoferritin בלא כתם נתן קוטר ליבה ממוצע של 8.2 ± 0.7 ננומטר, ואת כתם aurothioglucose אשר את נוכחותו של חלקיקים בתוך כלוב החלבון. ראוי לציין, כי תמונות מראות מדגם magnetoferritin כי היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית לבודד ליבות ננו-חלקיקים אחידים. דגימות Magnetoferritin כי לא היו מטוהרים מגנטיים יש התפלגות גודל ליבה רחבה מעט. 29 ניתוח של מבנה הליבה magnetoferritin באמצעות התאבכות אלקטרונים נבחרים באזור הצביעו על נוכחות אפשרית של מבנה ספינל ההופכי מבוסס על מגנטיט (Fe 3 O 4) ו / או מגהמיט (γ-Fe 2 O 3), כמו גם את מבנה ספינל בשל Co 3 </sub> O 4. יתר על כן, ספקטרום ראמאן חשף פסגות לייחס Fe 3 O 4, כמויות קטנות של γ-Fe 2 O 3, ו פרית קובלט (איור 1 ג). ICP-OES ניתוח magnetoferritin הראה בממוצע 102 מיקרוגרם של ברזל ו -0.9 מיקרוגרם של קובלט מיליגרם של magnetoferritin. סכימטי כלול, הממחישות את הצעד cationization עוקבות (איור 2 א). הקוטר הידרודינמית של magnetoferritin ו cationized magnetoferritin היה 11.8 ± 1.1 ננומטר ו -12.5 ± 1.4 ננומטר, בהתאמה, כפי שנקבע על ידי פיזור אור דינאמי. היעילות cationization של צימוד DMPA קוולנטיים כדי magnetoferritin הוערכה באמצעות potentiometry zeta ו יינון desorption לייזר בסיוע מטריקס הזמן של הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה. הפוטנציאל זטא שונה מ -10.5 mV עבור MF כדי + 8.3 mV עבור magnetoferritin cationized, המאשרלשנות בפוטנציאל משטח משלילי לחיובי (טבלה 1). ניסויים ספקטרומטריית מסה מצאו משקל מולקולרי למקטע של 20.1 kDa עבור apo-פריטין ו- 21.1 kDa מקוריים עבור (B איור 2) apo-פריטין cationized. עלייה המונית זו תואמת כ -12 מולקולות DMPA מצמידים לכל למקטע חלבון, ואת cationization של 288 שאריות על חלבון 24 למקטע כולו. רווית רגישות מגנטית נמדדו באמצעות magnetometry תמנונים, רוחבי relaxivity האורך נמדדו באמצעות תהודה מגנטית. תכונות מגנטיות היו דומות magnetoferritin ו magnetoferritin cationized, המציין כי היה cationization השפעה זניחה על התכונות המגנטיות של SPION הסגור (טבלת 1). יתר על כן, מאפיינים אלה דומים חלקיקים מבוססי תחמוצת ברזל אחרים, 19,30 הוכחה כי cationized Magnetoferritin יהיה מתאים כמו סוכני SPION מבוסס קונבנציונליים ניגוד MRI בשיפור לעומת הדמיה. לאחר חשיפה של 30 דקות, פני התא היה מכוסה בצפיפות magnetoferritin cationized (איור 3 א). עם זאת, לאחר שבוע, לא נמצאו חלקיקים על פני התא (איור 3 ב '). magnetoferritin Cationized היה יעיל להפליא hMSCs תיוג מגנטי. יש לציין, חשיפת תאי magnetoferritin cationized למשך דקה אחת הביאה המגנטיזציה של 92% של אוכלוסיית התא ואת הביצוע של 3.6 pg של ברזל לכל תא. הגדלת זמן הדגירה עד 15 דקות הביאו את המגנטיזציה של אוכלוסיית התא כולו (C איור 3). איור 1: אפיון magnetof ליבות erritin מסוממים עם 5% קובלט. תמונות TEM של magnetoferritin מוכתם aurothioglucose (א) ו בלא כתם (B). הבלעה מראה עקיפת אלקטרונים מקבילה עם מדדי מגנטיט. סרגל קנה מידה: 20 ננומטר. (C) ראמאן הספקטרום עבור magnetoferritin. החצים מציינים את מצבי רטט ראמאן העיקריים פרית קובלט (2G T), מגנטיט מגהמיט (הן A 1G). 31,32 אורך הגל לייזר המשמש היה 532 ננומטר. (תמונה מותאמת Okuda et al. 18). שים לב מדגם magnetoferritin זה היה מטוהרים נוספים באמצעות פרדה מגנטית, אשר מבודדת חלקיקי magnetoferritin טעונים באופן אחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 785fig2.jpg "/> איור 2: Cationization של magnetoferritin. א) ייצוגים שטח פנים נגישים מרכך המציגים את ההתפלגות (אדום חומצי) ובסיסיות (צהובות) שאריות חומצת אמינו על פני החלבון. Magnetoferritin (1) הוא שונה magnetoferritin cationized (2) על ידי crosslinking בתיווך carbodiimide של DMPA שאריות חומצת אמינו חומצי על פני החלבון (3). ב) ניתוח ספקטרומטריית מסה של יחידות משנה apo-פריטין ו cationized apo-פריטין. Mass-ל-תשלום (m / z) ספקטרום של apoferritin (ApoF) ו apoferritin cationized (חתול-ApoF) שנוצר על ידי MALDI-TOF. עלייה המונית 20.1 kDa כדי 21.1 kDa הוא ציין לאחר cationization. (תמונה המותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> איור 3: תיוג מגנטי תא הפרדת hMSCs מודגרות עם magnetoferritin cationized. א) תמונת TEM של hMSCs לאחר הדגירה 30 דקות עם magnetoferritin cationized. החץ מעיד על קיומו של ליבות magnetoferritin צפופים על פני התא. ברי סולם: 200 ננומטר. B) תמונת TEM של hMSC שבוע לאחר תיוג. פני התא ברור של magnetoferritin cationized. ג) לחקור את המהירות של תיוג מגנטי: 92% מאוכלוסיית התא היה ממוגנטים לאחר חשיפה של דקה אחת עם 0.5 מיקרומטר cationized magnetoferritin, לבין אוכלוסיית התא כולו ממוגנטת תוך 15 דקות. תוכן ברזל לכל תא נקבע באמצעות ICP-OES. ממוצע וסטיית תקן משלושה ביולוגי משכפל מוצגת. (תמונה מותאמת קוריאה Carreira et al. 15) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. MF חתול-MF קוטר הידרודינמית [nm] 11.8 ± 1.1 12.5 ± 1.4 [MV] פוטנציאל זטה (-) 10.4 ± 0.2 8.3 ± 0.7 רגע רוויה מגנטי [Am 2 קילו -1] 54.9 ± 1.6 55.3 ± 1.4 רגישות Mass [x 10 4 מ 3 קילו -1] 1.75 ± 0.08 1.75 ± 0.07 Relaxivity אורך [sec -1 מ"מ -1] 2.6 ± 0.1 2.3 ± 0.1 Relaxivity רוחבי [sec -1 מ"מ -1] 44.6 ± 1.0 52.8 ± 0.8 טבלה 1: אפיון physicochemical של magnetoferritin (MF) ו magnetoferritin cationized (חתול-MF). (לוח מותאם קוריאה Carreira et al. 15)

Discussion

TEM של דגימות magnetoferritin מוכתמות aurothioglucose חשף את מינרליזציה המוצלח של חלקיקים בתוך כלוב החלבון. עקיפת אלקטרוני ראמאן ניתוח של ליבת nanoparticle הצביעו על הנוכחות של פרית קובלט, המציין סימום מוצלח של ליבת ננו-חלקיקים עם קובלט. מכך ניתן להסיק כי חלקיקים מעורבת-תחמוצת יכול להיות mineralized בהצלחה בתוך חלל apo-פריטין. יתר על כן, אנו הראינו בעבר כי סימום קובלט ניתן לשנות על ידי שינוי כמות מבשר קובלט הוסיפה לתערובת התגובה, המאפשרת כוונון של התכונות המגנטיות. 18

סינתזת Magnetoferritin יכולה להתבצע במגוון של כלי, כל עוד הם בחוזקה סגר ויש יציאות גישה שדרכו מגיבים יכולים להיות הציגו (למשל, בקבוק תחתי עגול שלושה צוואר). טמפרטורת התגובה צריכה להישמר על 65 מעלות צלזיוס או על ידי נחת כלי השיטבאמבט מים / שמן או מתוך כלי כפול במעיל. הנה, השתמשנו במערכת של תא אלקטרוכימי פעמיים במקטורן לבצע את הסינתזה. כדי להבטיח סינתזה מוצלחת, שמירה על pH הנכונה והימנעות זיהום החמצן של התמיסות המימיות הוא קריטי. פתרונות מלח מתכת צריך תמיד להיות מוכן טרי לפני השימוש ולא מראש. יתר על כן, פתרונות apoferritin מסחריים יכולים להשתנות באיכות ולהשפיע תוצאת סינתזה (למשל., גודל mineralized ליבת ננו-חלקיקים). היא יכולה לסייע בהפחתת dialyze הפתרון apoferritin לתוך 50 מ"מ HEPES חיץ (pH 8.6) לפני סינתזה כדי להסיר כל סוכן שיורית צמצום בשימוש על ידי היצרן. כדאי לעשות לעצמך את מספר האצווה של הפתרון apo-פריטין המשמש לסינתזה, כך שהוא יכול להיות ביקש במפורש לקבל מהיצרן צריך הצורך חומר נוסף כדי לרכוש. יתר על כן, את ריכוז החלבון של זמינים מסחריים-פריטין apo יצוין על הבקבוק, אשר יכוללשמש כדי לחשב את עוצמת הקול של פתרון apo-פריטין הדרושים סינתזה. אם זה לא המקרה, פנה אל הספק לקבלת מידע זה.

היתרון של תוספת ההדרגתית של מלחי מתכות ואת מי חמצן – כפי שהוצג פה בדוחות קודמות – הוא כי מינרליזציה של ליבת nanoparticle ניתן לשלוט כאלה שגורמים טעינה שונה (כלומר, בגדלי ננו-חלקיקים) יכולים להיות מושגת. 33 יתר על כן, אפשר לטהר magnetoferritin נוספת באמצעות טור פרדה מגנטי, למשל, טור ארוז עם אבקת נירוסטה המאובטחת בתוך אלקטרומגנט. 34 לכן, מאוד ליבות nanoparticle monodisperse ניתן לבודד מן המדגם magnetoferritin בתפזורת. עם זאת, עבור תא תיוג מגנטי כפי שהוצג כאן זו אינה נדרשת. הגבלה של סינתזת magnetoferritin נקבעה בהתאם לתשואת סינתזה הנמוכה יחסית של כ -10%, ואת העלות הגבוהה יחסית של מסחר apo-Feפתרונות rritin. עם זאת, apo-פריטין יכול גם להיות מוכן מן טחול סוס בזול זמין פריטין ידי ביצוע פרוטוקולי דה-מינרליזציה הוקמו. 16

Cationization של magnetoferritin הושגה על ידי הוספת טוחנת יחס של 250 מולקולות של DMPA ו -50 מולקולות של EDC לכל שאריות מטען שלילי (חישובים המבוססים על רצף החומצות האמיניות של פריטין הטחול סוס). עודף זה של מגיב על חלבון הביא יעילות גבוהה cationization, דומה גם שדווח בעבר תוצאות עבור cationization של פריטין. 35 לניתוח MALDI-TOF, apoferritin ו cationized apoferritin שימשו בגלל המסה המולקולרית יתר של הליבה magnetoferritin. תשואה גבוהה יעילות cationization, חומציות אופטימלית היא גם חיונית. crosslinking בתיווך EDC הוא יעיל ביותר בתנאים חומציים במקצת, ומצאנו כי pH 5 הניבה תוצאות cationization אופטימליות magnetoferritin. עם זאת, עבור ג חלבונים אחריםpH ationization עשוי צריך להיות מותאם. Cationization בבית או קרוב לנקודת איזואלקטרית של חלבון יש להימנע, כיוון שהדבר עלול להוביל משקעים קשים.

המגנטיזציה תא גזע עם magnetoferritin cationized הייתה יעילה מאוד יכולה להיות מושגת באמצעות פעמי דגירה גם מתחת ל -30 דקות. אפילו דגירה של דקה אחת הביאה תכולת ברזל הסלולר של 3.6 pg, אשר נמצא בטווח דיווח נדרש להשפיע T2 ו- T2 * בניגוד עבור MRI. 36,37 זה גם ראוי לציון, כי תיוג יעיל זו מושגת עם ריכוזי ברזל תאיים נמוכים. לדוגמה, מחקרים קודמים באמצעות חלקיקים anionic מדווחים על רמות ברזל של 10 pg לכל תא לאחר תקופת דגירה של 30 דקות עם ברזל 5 מ"מ. 38 לשם השוואה, דגירה עם פתרון magnetoferritin cationized המכיל 0.5 מיקרומטר חלבון מתאימות דגירה עם כ 0.2 ברזל המ"מ וגם בתשואה של כ -10 pg של ברזל ל cell אחרי 30 דקות. לא הצלחנו לזהות שום שלפוחית ​​endocytotic בבירור באמצעות TEM. עם זאת, מחקרים קודמים באמצעות פריטין cationized מצאו כי הפנמה התרחשה בתוך עשר הדקות הראשונות של חשיפה. פריטין 39,40 Cationized יכול להיות מקומי שלפוחית מצופית, המציין אנדוציטוזה clathrin- או caveolin התלוי. אותו מחקרים דיווחו גם כי לאחר 30 דקות של דגירה, פריטין cationized היה עדיין קיים על פני התא, כמו גם בגופים multivesicular, הדומה lysosomes.

יישומים נוספים יכולים לכלול cationization של כלובי apo-פריטין עמוס חלקיקים אחרים ו / או מולקולות תפקודיות, כגון תרופות נוגדת סרטן 41 או 42 נקודות קוונטיות. Cationization של מבנים פריטין אלה עלולים לגרום משלוח מהיר ויעיל יותר של המטענים שלהם לתאים.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BPE310-1 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen Sigma Aldrich A3641 we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate  Sigma Aldrich C6768 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate  Sigma Aldrich F1543 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%) Sigma Aldrich 216763 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate Sigma Aldrich S1804 powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron Merck Millipore SLGP033RS syringe filter
Trizma base Sigma Aldrich T1503 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride Sigma Aldrich 31434 poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units Merck Millipore 4310 Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis Merck Millipore UFC801024 Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL
ANX Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-1287-04 we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column  GE Healthcare 17-1196-01 this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system GE Healthcare 28406264
sample pump P-960 GE Healthcare 18-6727-00 load sample at a flow rate of 10 mL/min
automated fraction collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00
Bradford assay reagent Sigma Aldrich B6916 solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen Sigma Aldrich F4503 prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) Sigma Aldrich 308110 CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E6383 keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) AppliChem A0689,0500 powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane Sigma Aldrich D9652 soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose Sigma Aldrich D5546 warm in 37 °C  water bath before use
fetal bovine serum Sigma Aldrich F7524 add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution Sigma Aldrich P0781 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
glutamax solution Gibco 35050-087 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor PeproTech 100-18B add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL
phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537 sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution Sigma Aldrich E5134 keep in freezer and defrost in 37 °C  water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E5134 powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albumin Sigma Aldrich A7030 add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand  Miltenyi Biotec 130-042-303 for attachment of MACS magnet
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-102 can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter Miltenyi Biotec 130-041-407 30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66% Sigma Aldrich 7006
Titrando 907, syringe pump Metrohm 2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5 Molecular Devices Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX JEOL Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer Renishaw Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser Laser Quantum Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme Applied Biosystems Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS Malvern Instruments Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System Quantum Design Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra Siemens Used to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin Spirit FEI Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES Agilent Used to determine iron content in cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
  2. Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
  3. Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
  4. Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
  5. Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
  6. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
  7. Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
  8. Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
  9. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
  10. Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
  11. Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
  12. Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
  13. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
  14. Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
  15. Correia Carreira, ., S, , et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
  16. Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
  17. Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
  18. Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
  19. Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
  20. Danon, D., Skutelsk E, M. a. r. i. k. o. v. s. Y., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
  21. Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
  22. Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
  23. Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
  24. Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
  25. Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
  26. Williams, A., Frasca, V., Coligan, J. E. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  27. Hagel, L., et al., Coligan, J. E., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  28. Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , 1 (2000).
  29. Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
  30. Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
  31. Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
  32. Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
  33. Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
  34. Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
  35. Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
  36. Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
  37. Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
  38. Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
  39. MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
  40. Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
  41. Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
  42. Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).

Tags

MagnetoferritinMagnetic NanoparticlesCell MagnetizationMRIMagnetic Cell SeparationApoferritinIron-cobalt PrecursorHydrogen PeroxideCationic MatrixSodium ChlorideTris Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Correia Carreira, S., Armstrong, J. P., Okuda, M., Seddon, A. M., Perriman, A. W., Schwarzacher, W. Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells. J. Vis. Exp. (118), e54785, doi:10.3791/54785 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image