細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

ヒト間葉系幹細胞（hMSCの）はブリストルSouthmead病院の研究倫理委員会のガイドライン（基準＃078/01）に完全に従うと、患者の同意を得た後に、人工股関節全置換術を受けて変形性関節症患者の近位大腿骨の骨髄から採取しました。 1. Magnetoferritin合成および精製 総説 金属前駆体の酸化を抑制するために窒素雰囲気下で65℃で密閉可能な、二重ジャケット反応容器中magnetoferritin合成を行います。シリンジポンプを用いて反応容器に蓋内のアクセスポートを介して金属塩溶液及び過酸化水素を注入します。 合成をmagnetoferritinした後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製タンパク質単量体を分離するために（セクション1.5を参照）サイズ排除クロマトグラフィーに続いてタンパク質の空洞に囲まれていないナノ粒子を除去するために、（1.4節を参照）。デブラッドフォードアッセイを用いてtermineタンパク質濃度（1.6節を参照）。 合成前の準備 、水中の窒素ガスボンベに接続されたチューブを配置ラップフィルムで容器を密封し、約60分間窒素ガスをバブリングすることによって脱イオン水500mlを脱酸素。 65°Cに二重ジャケット付き反応容器に接続された水浴を加熱します。約20分間の緩衝液に窒素ガスをバブリングして、反応容器中に50 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（pH 8.6）75 mlを加え、容器を密閉し、酸素を除去します。同時に、マグネチックスターラーを用いて緩衝液をかき混ぜます。 HEPES緩衝液を脱酸素した後、バッファからの窒素ガスの供給管を除去し、窒素雰囲気を維持する容器中に懸濁させておきます。 3ミリグラム/ Mの最終濃度を達成するために、アポフェリチンを追加リットル。磁気攪拌を継続したが、発泡が発生した場合、撹拌速度を低下させます。 脱酸素した脱イオン水50mlに0.19グラムを溶解することにより、硫酸コバルト七水和物の25 mMストック溶液を調製します。 脱酸素脱イオン水100ml 0.98 gで溶解させてアンモニウム硫酸鉄六水和物溶液の25mMの溶液を調製します。 アンモニウム硫酸鉄六水和物溶液を2.5ミリリットルを削除し、硫酸コバルト七水和物の2.5ミリリットルと交換してください。 最初の脱酸素脱イオン水9 mlの過酸化水素溶液（30％w / w）のの965μLを添加し、次いで99 mlにこのサブストックを1ml添加することにより脱酸素脱イオン水中の過酸化水素の8.33ミリモルの溶液を調製します脱酸素した脱イオン水。 Magnetoferritin合成 sの磁気（アポフェリチン溶液中に同時に鉄コバルト前駆体と過酸化水素の両方の10.1ミリリットルを注入しtirred）は、2つのシリンジポンプ（注入された総体積用いて0.15 ml /分の流速：20.2ミリリットル）。 注入期間中に、脱イオン水をさらに500ミリリットル脱酸素。 注：反応容器の内容物を徐々に反応が進行するにつれて、暗褐色の色を採用しています。 間もなく最初の注射が完了する前に、鉄 – コバルト前駆物質と新たに脱酸素脱イオン水を使用して、過酸化水素溶液の別の100mlと準備します。 鉄コバルトと過酸化水素の新たに調製された溶液を用いて、1.3.1で説明した射出工程を繰り返します。 噴射期間中に、脱イオン水の別の500ミリリットルを脱酸素化し、1.3.3と1.3.4で説明したように進みます。 3回目の注射の後、撹拌下で15分間成熟するソリューションを残します。 溶液中の遊離金属イオンをキレート化するために、反応容器に1 Mクエン酸ナトリウム溶液1.5mlを加えます。 反応からの溶液を除去50ミリリットルの遠心分離管、4350×gで30分間遠心分離し、0.22μmのシリンジフィルターを通して上清を渡すに容器。この段階で、濾過した上清を精製まで4℃で保存することができます。 イオン交換クロマトグラフィー 10ml /分の流量で、蠕動ポンプを使用して、カチオン性マトリックスを含有するカラム（長さ20cm直径2.5cm）にサンプルをロードします。 10ml /分の流速で勾配ポンプを用いて緩衝液（50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液、pH 8.0）を実行して約100mlでカラムを洗浄します。 150、500から1,000 mMの最終NaCl濃度、各濃度を150ml：タンパク質を溶出し、トリス緩衝液中の塩化ナトリウム（NaCl）の濃度を増加させて10ml /分でカラムを洗浄します。 タンパク質は、500mMのNaCl濃度で溶出するように、自動化されたフラクションコレクターを使用して、50ミリリットルの画分でそれを集めます。 注：についてイオン交換クロマトグラフィーの詳細なプロトコールは、以前に公開されたプロトコルを参照してください。 26 サイズ排除クロマトグラフィー 4ml容量部でを15 mlの遠心フィルターユニットを用いて約2 mlの容量にmagnetoferritin 150mlのを濃縮します。この手順の詳細なプロトコルのための（材料のリストを参照）遠心分離フィルターユニットの製造元の説明書を参照してください。 注入ループを用いたゲルろ過カラムに濃縮サンプルをロードします。 1.3 ml /分の流速で（150mMのNaClを含む50mM Tris緩衝液、pH8.0）でランニングバッファーでカラムを洗浄します。 自動化されたフラクションコレクターを使用して6ミリリットルの画分を収集します。タンパク質単量体は、最後の溶出します。この時点で、精製magnetoferritinはカチオン化まで4℃で保存することができます。 NOTE：ゲルろ過カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーの詳細なプロトコルは、相談のためpreviouslyプロトコルを発表しました。 27 タンパク質濃度を決定します 市販のウマ脾臓フェリチンを用いて、50mMのトリス緩衝液中で0.06、0.125、0.25、0.5及び1 mg / mlでのフェリチン基準を準備します。 注：市販のフェリチンのタンパク質濃度は、ボトルに記載されています。ない場合は、この情報をサプライヤーにお問い合わせください。 溶液の色は、約0.5 mg / mlで標準の色と一致するまで、50mMのトリス緩衝液中の未知の濃度のmagnetoferritinサンプルを希釈します。希釈係数をメモします。 96ウェルプレートのウェルに三連の各標準とmagnetoferritin10μlのサンプルを追加します。 （ブラッドフォードアッセイ試薬の詳細については、材料リストを参照）を各ウェルに既製のBradford試薬200μlのを追加します。 8分間室温でインキュベートします。 使用してλ= 595 nmの吸光度を測定しますマイクロプレートリーダー。 タンパク質濃度の関数としてのフェリチン標準の吸光度を意味し、magnetoferritin試料の濃度を計算するために線形フィットの傾き及び切片を使用してプロットします。 注：アカウントに標準曲線にmagnetoferritinサンプルを調整するために使用された希釈倍率を取ります。 2. Magnetoferritinカチオン化 総説 注： – （3-ジメチルアミノプロピル） – N 'エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）magnetoferritinのカチオンは、N、Nをジメチル-1,3-プロパンジアミン（DMPA）は、Nを用いてMF表面にアスパラギン酸およびグルタミン酸残基に結合させました。 攪拌下、室温で反応を行います。下記のプロトコルを5ml（タンパク質濃度を2mg / ml） を全量magnetoferritinを10mgのカチオン化のためのものです。しかし、アップまたはスケールダウンDMPA：EDC比一貫性、ならびに緩衝液およびmagnetoferritin液の容量の蛋白質を保つことによって。 カチオン化反応に先立って、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）にmagnetoferritinサンプルを透析します。これは、トリス溶出緩衝液を除去し、トリスアミンおよびEDC活性化カルボン酸の残基間の望ましくない反応を避けることが重要です。透析後のタンパク質濃度を決定し、カチオン化する前に4mg / mlに調整してください。 カチオン化プロトコル DMPAの374ミリグラムを秤量し、200mMの2-（Nのモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液の2.5ミリリットルに溶解します。 濃縮して、（6 M）塩酸（HCl）を用いて、溶液のpHを約7に調整します。 注意：DMPAに酸を添加すると、有毒ガスを放出するように、ドラフト内で、この手順を実行します！ 4 mg / mlででmagnetoferritin溶液を2.5ミリリットルを追加します（最終concenMESのtrationは、magnetoferritinの最終濃度が2 mg / mlであり、タンパク質の合計量）は10 mgで100 mmです。 平衡化するために2時間磁気撹拌機や撹拌を加えます。 1 M HClを用いてpHを5.0に解決策を慎重に調整します。 DMPA / magnetoferritin溶液にEDC粉末の141ミリグラムを追加します。 3.5時間攪拌し続けます。 任意の沈殿物を除去するために0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 透析緩衝液を交換し、12-14 kDaの分子量カットオフを有する透析チューブに溶液を添加し、4℃で2日間、50mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液（pH 7）の4リットルに対して透析少なくとも三つその期間中回。 注：この時点で、カチオンmagnetoferritinはさらなる使用まで4℃で保存することができます。 カチオン化Magnetoferritin 3.ヒト間葉系幹細胞標識 総説 <li>は、37℃、5％二酸化炭素雰囲気でクラスIIクリーンベンチ及び加湿インキュベーターを使用して、すべての細胞培養を行います。 4日間-すべての3補充した175cm 2のフラスコおよび培養培地20mlを用いて単層として培養細胞。培養培地は、1000 mg / Lのグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のウシ胎児血清、1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシン溶液、1％（v / v）のLから成っ-alanyl -L-グルタミン溶液、および5 ngの/新たに補充mlのヒト線維芽細胞増殖因子。 カチオン化magnetoferritinでのhMSCの磁気標識 シード15万25cm 2のフラスコへのhMSC、37℃で一晩付着したままにします。 フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通してカチオン化magnetoferritinを殺菌し、タンパク質濃度を決定します。 カチオン化magnetoferriの0.5μM溶液を調製、無菌状態を維持リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の錫。使用するまで無菌培養フードに蓋をしてください。 室温PBSの2mlで播種した細胞を洗浄。 播種した細胞に滅菌したカチオン化magnetoferritin溶液1mlを加え、所望の時間（1分〜1時間）インキュベートします。 トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を0.5mlを添加し、5分間37℃でインキュベートすることにより、PBSで細胞を、その後収穫細胞を洗浄します。 トリプシン/ EDTAを不活性化する524×gで5分間、15mlの遠心チューブと遠心分離機に溶液を転送するために、培養培地1mlを加えます。 上清を捨て、ウシ胎児血清およびPBS中の2mMのEDTA（w / v）の0.5％からなる、0.5ミリリットルで細胞ペレット磁気分離バッファを再懸濁。 磁気細胞分離 マルチスタンドに磁石を取り付け、磁石に磁気分離カラムを追加します。目の前の分離フィルタを配置E列。 プレ分離フィルタで磁気分離バッファの0.5ミリリットルを置き、フィルタおよび洗浄し、それらを濡らす列の両方を介して実行してみましょう。 列の下に15ミリリットルの遠心分離管を配置します。 磁気分離カラムのフィルター容器内の細胞懸濁液を0.5mlを加えます。 リザーバが空になると、磁気分離バッファの0.5ミリリットルを追加します。 リザーバが空になると、磁気分離緩衝液のさらなる0.5ミリリットルを追加します。 （洗浄に用いた磁気分離緩衝液の全量を1.5ミリリットルでなければならない）もう一回繰り返します。この洗浄工程は、カラム（非磁化細胞画分）からすべての非磁性細胞を溶出します。 磁石から列を削除し、新鮮な15ミリリットルの遠心管に入れてください。カラムリザーバーからフィルターを取り外します。 リザーバーに磁気分離緩衝液1mlを加え、直ちに製造により供給されたプランジャーを使用してカラムを押し通しますrを。これは、遠心分離管（磁化細胞画分）にカラムから磁化細胞を溶出します。 524×gで5分間遠心チューブの両方。 上清を捨て、0.3ミリリットルのPBSで細胞ペレットを再懸濁。 血球計数器を使用して、各画分中の細胞数の数をカウントします。 磁化された細胞の割合を決定し、M（％）は、以下の式を用いて。 ここで、n（M）は、磁化の画分中の細胞の数およびn（M + NM）は、磁化および非磁化画分中の細胞の数の和です。 誘導結合プラズマ発光分光法（ICP-OES）を用いて、鉄定量のためにカチオン化magnetoferritinで標識したhMSCの調製 注：プロトコルは、他のICP-OESの楽器のために適合させる必要があるかもしれません。再と相談することをお勧めしますsponsible技術者。 遠心分離機524×gで5分間、細胞の既知の数。 PBSの上清を除去し、50％（v / v）の硝酸の0.25ミリリットルを追加します。 渦は、酸性化細胞懸濁液を混ぜます。 室温で一晩インキュベートします。 各サンプルと渦ミックスに蒸留水4.75ミリリットルを追加します。 ICP-OESで分析します。 28 細胞の鉄含有量の値を決定するために細胞数を測定した鉄含有量を正規化します。