A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
Molte importanti applicazioni biomediche, come l'imaging cellulare e la manipolazione a distanza, possono essere realizzati mediante l'etichettatura di cellule con superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs). Il raggiungimento sufficiente assorbimento cellulare di SPIONs è una sfida che è stata tradizionalmente incontrato esponendo le cellule a concentrazioni elevate di SPIONs o prolungando i tempi di esposizione (fino a 72 ore). Tuttavia, queste strategie sono suscettibili di mediare tossicità. Qui, presentiamo la sintesi del SPION magnetoferritin base di proteine, nonché una facile protocollo funzionalizzazione superficiale che consente una rapida magnetizzazione cellulare utilizzando concentrazioni di esposizione basse. Il nucleo SPION di magnetoferritin costituito da ossido di ferro-cobalto drogati con un diametro medio delle particelle di 8.2 nm mineralizzata all'interno della cavità del cavallo milza apo-ferritina. cationizzazione chimici di magnetoferritin prodotto un romanzo, SPION altamente membrana attivo che magnetizzato cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) con tempi di incubazione comebreve come le concentrazioni di un minuto e ferro come bassi come 0,2 mm.
vincolanti superficie o internalizzazione di superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs) ha permesso di magnetizzazione di una varietà di tipi di cellule per applicazioni quali l'imaging e la manipolazione a distanza. 1 Tuttavia, ottenendo sufficiente magnetizzazione cellulare può essere una sfida, soprattutto quando l'interazione tra il SPION e la superficie cellulare è debole. 2 Negli ultimi concentrazioni, l'esposizione prolungata o ad alta spion sono stati impiegati come strategie per superare questa sfida. 3,4 Tuttavia, queste strategie sono problematici perché aumentano la tossicità 5,6 e hanno un successo molto limitato in tipi di cellule con i tassi bassi di interiorizzazione, come i linfociti. 7 Per migliorare l'assorbimento cellulare di SPIONs, approcci di funzionalizzazione diverse superfici sono state esplorate. Per esempio, gli anticorpi sono stati utilizzati per promuovere endocitosi mediata da recettori, 8 mentre assorbimento non specifico può essere ottenuto utilizzando una trasfezionesignori 9,10 o specie cellule penetrante, come l'HIV tat-peptide. 11,12 Tuttavia, anticorpi e peptidi funzionalizzazione approcci sono limitati dai reagenti costosi e preparazione di sintesi complessi, mentre gli agenti di trasfezione possono indurre nanoparticelle precipitazioni e influenzare negativamente la funzione delle cellule. 13,14
Recentemente abbiamo riportato la sintesi di magnetoferritin cationizzata chimicamente, un romanzo SPION che era molto efficace in cellule staminali mesenchimali umane di magnetizzazione (hMSCs) con tempi di incubazione più brevi di un minuto. 15 Magnetoferritin è sintetizzato dalla ricostituzione di una SPION all'interno della cavità de-mineralizzato della proteina ferritina deposito del ferro. 16 Questo SPION base di proteine combina molte proprietà che lo rendono particolarmente adatto per la magnetizzazione delle cellule, come il controllo sulle proprietà magnetiche del nucleo magnetico, 17-19 e la biocompatibilità e la solubilità acquosa conferiti dalla shell proteine. Ulteriorepiù, funzionalizzazione superficiale è facilmente ottenibile a causa aminoacidi indirizzabili che possono essere chimicamente 20-22 o geneticamente modificati. 23-25 Abbiamo dimostrato che cationizzazione chimica degli acidi residui di aminoacidi del guscio proteina genera una nanoparticella stabile che prontamente ha interagito con i domini anionici sulla superficie cellulare che porta alla magnetizzazione cellulare rapida e persistente. Questa procedura elimina la necessità di funzionalizzazione laboriosa e protocolli di incubazione lunghi, e grazie al meccanismo marcatura non specifica questa strategia magnetizzazione rapida dovrebbe trovare applicazione diffusa in altri tipi di cellule. Qui, vi presentiamo una profonda relazione del metodo di etichettatura delle cellule ultra-veloce, inclusi i protocolli dettagliati della sintesi, la purificazione e la superficie funzionalizzazione di magnetoferritin cationizzata.
TEM di campioni magnetoferritin colorati con aurothioglucose rivelato la mineralizzazione successo di nanoparticelle all'interno della gabbia di proteine. Electron diffrazione e analisi Raman del nucleo nanoparticella indicavano la presenza di una ferrite di cobalto, indicando drogaggio successo del nucleo nanoparticelle con cobalto. Ciò dimostra che le nanoparticelle ossidi misti possono essere correttamente mineralizzata entro la cavità apo-ferritina. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che il cobalto doping può essere variato modificando la quantità di cobalto precursore aggiunto alla miscela di reazione, che consente la sintonizzazione delle proprietà magnetiche. 18
Sintesi Magnetoferritin può essere eseguita in una varietà di navi, purché siano ermeticamente sigillato e hanno porte di accesso attraverso il quale possono essere introdotte reagenti (ad esempio, a tre colli rotonda pallone a fondo). La temperatura di reazione deve essere mantenuta a 65 ° C mediante l'immissione nel recipientea / a bagno d'olio d'acqua o usando un recipiente a doppia camicia. Qui, abbiamo utilizzato una configurazione a doppia camicia cella elettrochimica per eseguire la sintesi. Per garantire riuscita sintesi, mantenendo il pH corretto ed evitando la contaminazione di ossigeno delle soluzioni acquose è cruciale. soluzioni saline metallo dovrebbe sempre essere preparati appena prima dell'uso piuttosto che in anticipo. Inoltre, le soluzioni apoferritin commerciali possono variare in termini di qualità e di influenzare il risultato di sintesi (ad es., Le dimensioni di nanoparticelle nucleo mineralizzata). Può aiutare a dializzare soluzione apoferritin in 50 mM tampone HEPES (pH 8,6) prima della sintesi di rimuovere qualsiasi agente riducente residuo usata dal fabbricante. E 'utile per prendere nota del numero di lotto della soluzione apo-ferritina utilizzato per la sintesi, in modo che possa essere espressamente richiesto dal produttore dovrebbe aggiuntivo bisogno materiale da acquistare. Inoltre, la concentrazione di proteine commercialmente disponibile apo-ferritina deve essere riportata sul flacone, che puòessere utilizzato per calcolare il volume di soluzione di apo-ferritina necessaria per sintesi. Se questo non è il caso, contattare il fornitore per queste informazioni.
Il vantaggio di graduale aggiunta di sali metallici e perossido di idrogeno – come presentato qui e in relazioni precedenti – è che la mineralizzazione del nucleo nanoparticella può essere controllata in modo che i diversi fattori di carico (cioè, le dimensioni di nanoparticelle) possono essere raggiunti. 33 Inoltre, è possibile purificare ulteriormente magnetoferritin usando una colonna di separazione magnetica, ad esempio, una colonna impaccata con polvere di acciaio inox fissata all'interno un elettromagnete. 34 Così, nuclei di nanoparticelle altamente monodisperse può essere isolato dal campione magnetoferritin massa. Tuttavia, per l'etichettatura delle cellule magnetiche come presentato qui questo non è richiesto. Una limitazione della sintesi magnetoferritin è relativamente bassa resa di sintesi di circa il 10%, e il costo relativamente elevato del commerciale apo-feSoluzioni rritin. Tuttavia, apo-ferritina può anche essere preparato da milza cavallo economicamente disponibile ferritina seguendo protocolli di de-mineralizzazione stabiliti. 16
Cationizzazione di magnetoferritin è stata ottenuta aggiungendo un rapporto molare di 250 molecole di DMPA e 50 molecole di EDC per residuo di carica negativa (calcoli basati sulla sequenza aminoacidica del cavallo milza ferritina). Questo eccesso di reagente più di proteine ha portato efficienze elevate cationizzazione, paragonabile anche riportato in precedenza i risultati del cationizzazione di ferritina. 35 Per l'analisi MALDI-TOF, apoferritin e apoferritin cationizzato sono stati utilizzati a causa della massa molecolare eccessiva del nucleo magnetoferritin. Per produrre efficienze elevate cationizzazione, pH ottimale è fondamentale. reticolazione EDC-mediata è più efficace in condizioni leggermente acide, e abbiamo scoperto che il pH 5 ha dato risultati ottimali cationizzazione per magnetoferritin. Tuttavia, per altre proteine cpH ationization può avere bisogno di essere ottimizzato. Cationizzazione in corrispondenza o vicino al punto isoelettrico della proteina deve essere evitato, poiché questo può provocare gravi precipitazione.
magnetizzazione delle cellule staminali con magnetoferritin cationizzata era altamente efficiente e potrebbe essere raggiunto utilizzando i tempi di incubazione e sotto i 30 minuti. Anche una incubazione di un minuto determinato un contenuto di ferro cellulare di 3,6 pg, che è compreso nell'intervallo riportato necessaria per influenzare T2 e T2 * contrasto per MRI. 36,37 È anche notevole che questa etichettatura efficace si ottiene con basse concentrazioni di ferro extracellulari. Ad esempio, gli studi precedenti utilizzando nanoparticelle anionici riportano livelli di ferro di 10 pg per cella, dopo un periodo di 30 minuti di incubazione con 5 mM di ferro. 38 In confronto, l'incubazione con una soluzione magnetoferritin cationizzata contenente 0,5 mM di proteine corrisponde a incubazione con circa 0,2 mM ferro e produce anche circa il 10 pg di ferro per cell dopo 30 minuti. Non siamo stati in grado di identificare in modo chiaro tutte le vescicole di endocitosi mediante TEM. Tuttavia, studi precedenti utilizzando ferritina cationizzata scoperto che internalizzazione si è verificata entro i primi dieci minuti di esposizione. 39,40 ferritina cationizzata potrebbe essere localizzata in vescicole rivestite, indicando endocitosi clatrina o caveolina-dipendente. Gli stessi studi hanno anche riferito che dopo 30 minuti di incubazione, ferritina cationizzato era ancora presente sulla superficie cellulare, così come nei corpi multivesicular, simile lisosomi.
Ulteriori applicazioni potrebbero includere cationizzazione di gabbie apo-ferritina carichi di altre nanoparticelle e / o molecole funzionali, come i farmaci anti-cancro 41 o 42 punti quantici. Cationizzazione di questi costrutti ferritina potrebbe tradursi in una consegna più rapida e più efficiente del loro carico per le cellule.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |